坐骨神经-腓肠肌标本的制备

第九章实验内容实验1坐骨神经-腓肠肌标本的制备【实验目的】掌握制备坐骨神经-腓肠肌标本的操作技术，为此后有关的神经肌肉实验打下基础。【实验原理】蛙或两栖类动物的一些基本生命活动及生理功能与温血动物近似，而且其离体组织需要的生活条件非常简单，易于控制和掌握。因此在生理学实验中，坐骨神经-腓肠肌标本是研究神经肌肉生理最常用的对象，经常用来研究神经肌肉的兴奋性、刺激与反应的规律、肌肉收缩的特点、兴奋性的周期性变化等。【实验器材和药品】蛙类手术器械一套（金属探针1根，粗剪刀、眼科剪刀各1把，圆头镊子、眼科镊子各1把，玻璃分针2根），蛙板和玻璃板各1块，培养皿，滴管，废物缸、锌铜弓，丝线，棉花；任氏液。【实验对象】蟾蜍或蛙。【实验方法和步骤】1．破坏脑和脊髓（常用的有三种方法）(1)俯式捣毁法：是最常用的方法。以左手持蟾蜍，将其腹面朝向手心，前肢夹在食指和中指之间固定，后肢夹在无名指和小指之间固定，并用拇指按压蟾蜍头部使之下俯30~40度角；然后右手持金属探针沿蟾蜍头部的中线下划，可触及一凹陷处即为枕骨大孔（图9-lA）。将探针从枕骨大孔垂直刺入1~1.5mm，再向前刺入颅腔，左右搅动（可感觉到探针与颅骨壁的碰击），破坏脑组织；再将探针退回至进针处，但不拔出而是转向后方刺入椎管，破坏脊髓。(2)仰式捣毁法：将蟾蜍仰卧于蛙板上，拉开下颌，右手持探针在颅底两眼之间向前下刺入颅腔，用探针在颅腔内向四周捣毁脑组织，然后将探针退至粘膜下，针尖向后平行刺入椎管内以破坏脊髓。(3)横断脊柱后捣毁法：左手持蟾蜍，右手持粗剪刀，在两腋窝稍下横断脊柱，然后在脊柱呈白色的脊髓断面处，向上插入探针破坏脑，再向下插入探针破坏脊髓。以上方法破坏脑和脊髓成功后，蟾蜍出现四肢（尤其是后肢）瘫软，并常有尿失禁现象。2．剪去躯干上部及内脏用粗剪刀在两侧腋部稍下（或在骶髂关节以上1.5~2cm处）剪断脊柱（图9-1B），用左手握住蟾蜍后肢，拇指按压骶骨，使蟾蜍头部及内脏自然下垂；避开腰骶神经丛后，右手用粗剪刀沿脊柱两侧剪开腹壁，在耻骨联合处将躯干上部及内脏剪掉，弃入废物缸内。3．剥皮左手持大镊子夹住脊柱断端(小心勿伤神经)，右手捏住脊柱断端的皮肤边缘，逐步向下剥去全部后肢皮肤（图9–1C）。将剥好的标本放置在盛有任氏液的培养皿中，或置于洁净的玻璃板上，滴加任氏液备用。然后洗手并清洗用过的手术器械。图9–l坐骨神经-腓肠肌标本的制备4．分离左右腿用圆头镊子夹住脊柱并提起，避开坐骨神经，用粗剪刀剪去向上突出的骶骨，沿脊柱正中线将脊柱从上向下分成两半，再从耻骨联合中央剪开（注意：剪开时应避免剪刀走“S”形，以保证坐骨神经的完整），将已分离的两腿浸入任氏液备用。亦可在游离大腿部位的坐骨神经后再分离两腿。5．游离坐骨神经取蟾蜍腿一条，用玻璃分针在大腿背面内侧沿坐骨神经沟（股二头肌与半膜肌之间）分离肌肉，暴露坐骨神经（图9–1D）。向上将梨状肌及其附近的结缔组织剪断，然后用玻璃分针沿脊柱自上而下轻柔游离坐骨神经腹腔部（坐骨神经呈亮白色束状），用眼科剪刀剪断神经的所有分支，在近脊柱处穿线结扎，从脊柱根部将坐骨神经剪断。也可以不结扎、不剪断神经，而保留一小块与神经相连的脊柱（约0.5cm×0.5cm左右），供握持神经用（图9–1D）。6．游离股骨将游离的坐骨神经轻轻搭在腓肠肌上，切断膝关节周围的大腿部肌肉，把股骨刮干净，然后剪去股骨小头并保留余下的股骨（约1~1.5cm），以便在固定神经肌肉标本时使用。7．完成标本用眼科镊子（或小剪刀）在跟健下方穿一洞，向上游离腓肠肌至膝关节处。穿线结扎腓肠肌跟健，左手提线，在结扎线远端剪断跟健。将膝关节以下的小腿其余部分全部剪去。以上过程应注意避免损伤神经，并随时滴加任氏液。至此即完成一个坐骨神经-腓肠肌标本（图9-2）的制备。图9-2坐骨神经-腓肠肌标本8．检查标本的兴奋性：用被任氏液浸湿的锌铜弓接触坐骨神经，如腓肠肌迅速收缩，则表示标本的兴奋性良好，可供有关神经肌肉生理实验用。【实验要求与注意事项】1．熟悉蟾蜍手术器械的使用方法，了解蟾蜍腿部的局部解剖及坐骨神经的走行。2．避免损伤蟾蜍背部的腺体（尤其是眼后的大腺体），防止其分泌物溅入眼内或污染标本。3．勿剪破蟾蜍内脏，并及时清洗手及用过的器械；已剥去皮肤的组织应避免接触蟾蜍皮肤或其他不洁物；以防标本被污染。4．游离神经、肌肉时不可过度牵拉，应避免用手指、金属器械接触或夹持标本的神经肌肉部分，更不能用自来水冲洗标本。5．制备过程中应经常向标本上滴任氏液，防止神经因干燥而失去正常兴奋性。标本制成后须放在任氏液中浸泡数分钟，使标本兴奋性稳定。6．移动制备好的标本时，先将游离的神经搭在腓肠肌上，再用双手分别提拿跟键和股骨断端，防止神经受力过重。【分析与思考】1．通过制备坐骨神经-腓肠肌标本，你对生理学实验有何感想?2．损毁脑和脊髓后的蟾蜍有何表现？若破坏脊髓不彻底，蟾蜍的四肢会有什么表现？为什么？3．为什么在本实验中应经常给标本滴加任氏液？4．锌铜弓为何能用来检查标本的兴奋性？若无锌铜弓，能否用其他方法来检查标本的兴奋性？实验2神经干动作电位的引导及其与刺激强度的关系【实验目的】学习神经干动作电位的记录方法，观察复合动作电位的波形、潜伏期、时程、幅值及其与刺激强度之间的关系，加深对生物电现象的理解，并初步掌握电生理实验的方法。【实验原理】神经组织是可兴奋组织，其生物电的表现形式主要有两种：一种是安静时的静息电位和受刺激时产生的动作电位。动作电位可沿神经纤维传导。将两个引导电极分别置于正常完整的神经干表面，神经干一端兴奋时，兴奋向另一端传播并依次通过两个记录电极，可记录到两个方向相反的电位偏转波形，称为双相动作电位。若两个引导电极之间的神经组织有损伤，动作电位只能到达第一个引导电极，而不能传导至第二个引导电极，此时只能记录到一个方向的电位偏转波形，称为单相动作电位。这种由许多神经纤维动作电位综合而成的复合电位，其电位幅度在一定范围内可随刺激强度的变化而变化。这一特点是和单条神经纤维的动作电位不同的。这是因为坐骨神经中包含许多种类的神经纤维成分，它们的兴奋阈值和传导速度等特点各不相同。所以，当刺激强度在一定范围内变化时，因参与兴奋的神经纤维的数目不同和其传导速度不同，会使复合动作电位的幅度和形状发生相应变化；当神经干因逐渐分支而变细时，复合动作电位的幅度也随之变小。【实验器材和药品】BL-410生物机能实验系统（或双线示波器、电子刺激器、前置放大器），神经标本屏蔽盒，蛙类手术器械一套，蛙板，玻璃板，废物缸，培养皿，滴管，棉花，线；任氏液。【实验对象】蟾蜍或蛙。【实验方法和步骤】1．制备坐骨神经干标本标本制备的前几步同坐骨神经-腓肠肌标本的制备（破坏蟾蜍的脑和脊髓、剪除躯干上部及内脏、剥皮、分离左右腿、游离坐骨神经）。坐骨神经在腘窝上方分为两支：胫神经走行表浅，位于腓肠肌内侧；而腓神经走行较深，位于腓肠肌外侧。若仅分离胫神经，则称为坐骨神经胫神经标本；若仅分离腓神经，则称为坐骨神经腓神经标本；若两者均分离，则称为坐骨神经胫神经腓神经标本。标本制备好后，浸入任氏液中10~15分钟备用。2．连接实验装置将BL-410生物机能实验系统和神经标本屏蔽盒连接好（或将双线示波器、电子刺激器、前置放大器连接好，调节其参数）。将标本置于神经标本屏蔽盒内的电极上，盖好盒盖。见图9-3。图9-3神经干动作电位引导装置3．仪器调试打开计算机，进入BL-410生物机能实验系统操作界面，点击实验项目→肌肉神经实验→神经干动作电位的引导→设置各项参数→确定。4．观察项目(1)在显示屏上得到一稳定的双相动作电位，观察其波形。若将两引导电极A、B对调，观察动作电位的波形有何变化？若用同样粗细长短的湿棉线代替神经干，动作电位是否出现？再换成原神经干标本结果如何？(2)改变刺激极性（对调两刺激电极）刺激伪迹的波形有何变化？(3)移动B引导电极，使A、B之间的距离加大，双相动作电位第二个波的形状有无改变？为什么？(4)在A、B两引导电极之间用小镊子夹伤神经干（注意不可夹断），在其他条件不变的情况下，观察动作电位的波形有无变化，是否由双相变为单相？(5)将刺激强度调零，然后逐渐增加强度，观察动作电位的幅值与刺激强度之间的关系，同时注意刺激伪迹与刺激强度之间的关系，并注意动作电位的波形有什么变化。【实验要求与注意事项】1．制备标本时应仔细去除附着在神经干上的结缔组织和血管，不可过度牵拉。2．不可向神经标本屏蔽盒内直接滴加任氏液，电极间不可有任氏液存在，以防短路。可将湿的滤纸置于盒底，以防盒内干燥。3．应将神经拉直后搭在电极上，不可折叠，也不可碰到屏蔽盒的壁上。4．神经标本屏蔽盒用毕应清洗擦干，防止电极生锈。【分析与思考】1．神经干复合动作电位的形状与细胞内记录的神经纤维的动作电位有何区别与联系?2．通常记录到的双相动作电位的第一相和第二相为何在波形、幅值上不对称？在什么情况下可记录到对称的双相动作电位？在什么情况下可记录到单相动作电位？3．在一定范围内，神经干动作电位的幅度为何随刺激强度的增大而增大？这与动作电位的“全或无”规律是否矛盾？4．何为刺激伪迹？在实验中如何辨别刺激伪迹与动作电位？用什么方法可减小刺激伪迹?5．能否设计一个实验，来验证神经纤维兴奋传导的双向性、相对不疲劳性和生理完整性？实验3神经干动作电位不应期和传导速度的测定【实验目的】学习神经干动作电位传导速度的测定方法，观测神经在发生一次兴奋后的兴奋性变化，并测定其不应期。【实验原理】可兴奋组织（神经、肌肉和腺体）在接受刺激后产生兴奋的能力称为兴奋性。当组织兴奋时，由于膜电位发生了一系列的变化，它的兴奋性也发生相应的变化，分为绝对不应期、相对不应期、超常期和低常期。调节双脉冲刺激之间的间距，可对其不应期进行测定。神经兴奋的标志是产生动作电位，其传播速度与神经纤维的粗细、有无髓鞘及环境温度等因素有关，通过测量神经冲动经过的路程和所需要的时间，可知兴奋传导速度的快慢。【实验器材和药品】BL-410生物机能实验系统（或双线示波器、电子刺激器、前置放大器），神经标本屏蔽盒，蛙类手术器械一套，蛙板，玻璃板，废物缸，培养皿，滴管，棉花，线；任氏液。【实验对象】蟾蜍或蛙。【实验方法和步骤】1．制备坐骨神经干标本制备方法同实验2“神经干动作电位的引导”实验，标本制备好后放置于盛有任氏液的培养皿中备用。2．连接实验装置将BL-410生物机能实验系统和神经标本屏蔽盒连接好（或将双线示波器、电子刺激器、前置放大器连接好，调节其参数）。将标本置于神经标本屏蔽盒内的电极上，盖好盒盖。3．仪器调试打开计算机，进入BL-410生物机能实验系统操作界面，点击实验项目→肌肉神经实验→神经干兴奋性不应期测定（神经干兴奋传导速度测定）→设置各项参数→确定。4．观察项目(1)观察神经干的不应期：选择双刺激，并逐步调节双刺激的间隔，可观察神经干的不应期。(2)测定传导速度：用两个通道同时记录时，可较准确的测定动作电位传导的速度。(3)通过相应的按键完成测量、存盘、打印等操作。【实验要求与注意事项】1．制备标本时应仔细去除附着在神经干上的结缔组织和血管，但不可过度牵拉标本。2．刺激电极与引导电极尽可能远些，并接好地线，调节刺激波宽，以防止刺激伪迹与动作电位融合而影响测量。3．神经标本屏蔽盒用毕应清洗擦干，防止电极生锈。【分析与思考】1．本实验测得的不应期、传导速度与单根神经纤维是否一样？为什么？2．不同组织的不应期是否相同，有何意义？3．若坐骨神经标本足够长，增大刺激电极与引导电极之间的距离，动作电位的波形将有何变化？为什么？4．仅用一对引导电极能否测定传导速度，应注意什么？实验4骨骼肌的单收缩和复合收缩【实验目的】观察刺激强度与骨骼肌收缩力量的关系及刺激频率对骨骼肌收缩形式的影响，了解单收缩、复合收缩的产生机制及其意义。【实验原理】肌肉组织具有兴奋性，受到刺激后会发生反应，表现为肌肉收缩。当刺激坐骨神经-腓肠肌标本时，在一定范围内，随着刺激强度的增大，参与兴奋的神经纤维和骨骼肌纤维的数目随之增多，骨骼肌的收缩力量