反相色谱法测定尼泊金甲酯的含量

反相色谱法测定尼泊金甲酯的含量实验目的了解高效液相色谱仪的基本结构及基本操作。了解反相色谱法的基本原理。掌握利用标准曲线法进行色谱定量分析的实验方法。实验原理高效液相色谱法定性液相色谱法是一种分离技术。试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程，因而当样品流出色谱柱的时间存在显著差异，从而使样品中各组分分离。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的液体，称为流动相。高效液相色谱可供选择的流动相种类较多，并可任意调配比例，通过改变溶剂极性或强度继而改变色谱柱效能、分离选择性和组分的容量因子，最后实现改善色谱系统分离度的目的。具有分析速度快、分离效率高、灵敏度高、易于实现操作自动化、适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的特点外标法定量即标准曲线法。因不使用校正因子故准确性较高；操作条件对结果准确性影响较大；对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。仪器与试剂色谱仪：waters1525，检测器：waters2489，色谱柱：键合在硅胶上的𝐶18。流动相：甲醇:水=3:2,0.1mg/ml的尼泊金甲酯标准液。实验步骤溶液的配制分别取0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml的0.1mg/ml尼泊金甲酯标准液，用流动相以总量0.5ml定容在离心管里。分别取0.1ml的尼泊金甲酯标准液和尼泊金乙酯标准液，混合在离心管里，用流动相定容至0.5ml。标准曲线的制作从左至右启动仪器，当检测器显示λ=254nm时打开计算机软件。设定参数冲洗柱体：流量A（水）=0，流量B（甲醇）=1。变化率=0.5min。点击“仪器”，设定TCM（柱温箱）=室温（25.6℃），PCM（泵）：等度流进A=0.4，等度流进B=0.6。W2489的采样速率=2点/s。返回控制面板，令系统走基线，若纵坐标在0.00000上下则可视为校正完毕。用进样器吸取各浓度样品，每次20μg，点击进样按钮，命名本次样品，设定运行时间为7min，点击确认。当系统提示ready时迅速将样品打入六通阀，并立即将扳手顺时针旋至60°处。每次运行完毕后记下保留时间和峰面积。检测完毕，清洗柱体，逆序关机。数据处理峰面积-浓度曲线：未知样：𝑡𝑅1=3.226min，𝑡𝑅2=7.255min。𝐴1=6395890，𝐴2=5956745。易知，1号为尼泊金甲酯，2号为尼泊金乙酯。带入方程可得𝐶尼泊金甲酯=0.053mg/ml，ε=𝐶−0.050.05=6.47%。浓度（mg/ml）保留时间/min峰面积0.023.24832280370.043.18946673970.063.22270741010.083.2479282624注意事项超纯水要经常更换。安装色谱柱时应使箭头朝下。使用双泵消除单泵的脉冲效应，令进样均匀。进样器中不能有气泡，以及进样后不要立即拔出进样器，以免混入空气。测定未知样时将运行时间设定为15min。y=1E+08x+920423R²=0.98992.E+063.E+064.E+065.E+066.E+067.E+068.E+069.E+061.E+070.020.030.040.050.060.070.080.09峰面积A浓度（mg/ml）峰面积-浓度