培养条件对阴沟肠杆菌乐果降解效能的影响

1培养条件对阴沟肠杆菌乐果降解效能的影响官雪芳1，2,刘波1*,林斌2,林抗美1,马丽娜1（1．福建省农业科学院生物资源研究所，福建福州350003；2．福建省农科院农业工程技术研究所，福建福州350003）摘要：从福建省福农生化有限公司排污口的土壤中筛选到一株对乐果有较好降解效果的菌株阴沟肠杆菌，为了使该菌能更好的应用于乐果残留污染的治理当中，特采用正交试验法L16（44×23）研究各培养条件对该菌降解乐果的降解效能的影响，结果为：该菌降解乐果的最佳发酵条件组合为处理5，具体为碳源：蔗糖、离子：CuCl2:(10Mmol·L-1)、乐果浓度：100mg·L-1、培养时间36h、培养温度30℃、pH值8、氮源：酵母3g·L-1，降解率达到58.90%，运用DPS数据处理系统分析各类因子对菌降解乐果的影响，得出离子对其作用影响最为显著，pH值、培养温度、乐果浓度、培养时间等也依次对菌降解乐果有较大的影响。关键词：阴沟肠杆菌乐果降解优化正交试验中图分类号：X172文献标识码：AEffectofcultureconditionsonEnterobactercloscaedegradingdimethoateGUANXue-fang1，2,LIUBo1*,LINBin2,LINKang-mei1,MALina1(1AgriculturalBioresourcesResearchInstituteFujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,350003,China,2InstituteofAgriculturalEngineeringTechnology;FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,350003,China)Abstrat:Byusingselectiveculturalmedia,Enterobactercloscaewasisolatedtodegradedimethoatefromthesoilaroundthepesticidefactory.Inordertomakeitbetterusedwithresidualdimethoate,theL16（44*23）orthogonaltestwasapplicatedtostudytheeffectivefactorsofthedegradationtodimethoateofE.closcae.Theresultsshowedthattheconformablecarbonsourceforthedegradationwassucrose,theionwasCu2+withthedensityof10Mmol/L,thedensityofdimethoatewas100mg/L,theoptimumtemperaturewas30℃,theinitialpHwas8.0,theconformablenitrogensourcewasyeastextractwiththedensityof3g/L,andtheculturetimewasfor36hwiththedegradingratesof58.90%,Meanwhile,usingtheDPSDateProcessingSystem,thesinglefactoreffectandsamplewerestatisticed.Theeffectofionhasthemostsignificantimpactonthedegradationofrates,andthenfollowedbypH,culturetime,densityofdimethoate,temperatureandcarbonsource.KeyWords:Enterobactercloscae,Dimethoate,Degradation,Optimizeorthogonalexperiments收稿日期：2009-2-12初稿；2009-修改稿作者简介：官雪芳（1979-），女，硕士，研究实习员，主要从事环境微生物方面的研究。E-mail:[e-mail]。*通讯作者：刘波(1957-)，男，博士，研究员，主要从事微生物生物技术和农业生物药物研究，E-mail：[e-mail]。基金项目：国家水体污染控制与治理科技重大专项《华南村镇塘坝地表饮用水安全保障适用技术研究与示范》，（编号：2008ZX07425-002）；福建省科技厅项目《有机磷农药降解剂“降磷灵”的研制》，（编号：2005Y008）。2有机磷农药一直是我国用量最大的农药种类，每年都在十万吨以上，它在给农业生产带来效益的同时也给人类带来了很大的污染问题，大量的这类农药施于农田后，只有大约1%作用于靶标生物，其余的或残留于土壤，或通过径流进入水域，影响土壤和水体中的生物，残留于土壤、水源、大气以及农作物中，这对人类及其环境产生深远的影响[1-4]。微生物是导致环境中有机磷农药降解的重要方式，农药微生物降解在农药废水处理和土壤生物修复等领域具有广阔的开发应用前景，因此筛选新菌株、提高已有菌株的降解性能、研究农药的微生物降解机制等一直是近几年来国内外研究的热点[5-8]。目前国内外已经在提高已有菌降解性能方面做了不少的研究[9-11]，其中包括环境因子对农药降解效能的影响研究等。谭芙蓉等(2001)筛选到一株对甲胺磷有降解效果的铜绿假单胞菌，并研究了底物浓度、接种量、营养源及金属离子对菌降解甲胺磷的影响，发现以上因素均不同程度影响着菌对甲胺磷的降解作用[12]；许育新等(2005)用GC-MS研究了红球菌CDT3降解氯氰菊酯的最适条件，发现温度、pH及碳源等因素也不同程度的影响着其降解效果[13]；另外也有报道其它环境影响因子如含水量、溶解氧、盐度、有机质、黏度及气候条件等影响微生物对农药的降解作用[14]。但在关于各类因素对影响微生物降解农药的效能分析等方面的研究目前未见有报道。本研究筛选到的一株对乐果有较高效的阴沟肠杆菌，经研究发现该菌具有生长速度快，生存适应能力强等优点[15]。由于环境因子对农药微生物修复的影响巨大，有些因子的影响有时甚至决定了农药微生物修复的成功与否[16]，因此本研究在对该菌降解乐果的各单因素进行研究的基础上(另文报道)，进一步运用正交试验法对碳源、离子、乐果浓度、培养时间、培养温度、pH值、氮源这7因素在影响阴沟肠杆菌降解乐果的情况方面做比较分析，目的在于分析比较各类因素对菌降解乐果的影响情况，筛选出阴沟肠杆菌降解乐果的最佳发酵条件组合，从而达到将该菌更好的应用于土壤、水体的乐果残留治理的目的，同时也为其它微生物降解农药的降解效能的因素研究提供理论参考。1．材料与方法1.1试剂与药品菌种：阴沟肠杆菌；药品：40%乐果乳油（湖南海利常德农药化工有限公司)，乐果标样（Sigma-Alddrich公司），丙酮（分析纯），二氯甲烷，乙腈（色谱纯），CdCl2，ZnCl2，CuCl2，FeCl2，氯化钠,盐酸，氢氧化钠（优级纯），果糖，蔗糖，葡萄糖，淀粉，酵母，蛋白胨等；葡萄糖蛋白胨水培养基：蛋白胨6.5g、葡萄糖6.5g、K2HPO42g、水1000ml、PH：7.0（固体培养基加琼脂20g）。1.2主要仪器设备Agilent1100HPLC仪（带VWD检测器及色谱工作站）,色谱柱：HypersiLODSC18反相柱（4.0mm×250mm，填料孔径5um）；真空抽滤器(2XZ-0.5型选片真空泵，浙江黄岩真空泵厂)；UV-2550紫外分光光度计，摇床，恒温箱，pH计，水浴锅等。1.3阴沟肠杆菌的培养取一环阴沟肠杆菌接种于100ml液体葡萄糖蛋白胨水培养基中32℃，160r·min-1条件下摇床培3养24h，作为接种液备用。1.4乐果的浓度和峰面积关系的标准曲线的制作将乐果标样用乙氰稀释成15、20、40、60、80、100mg·L-1，再将各标样用液相色谱仪测定，液相色谱操作条件为[17]:流动相：V（乙氰：水）=30：70，流速：1mL·min，波长：210nm，出峰时间：7.59min。每次进样10ul，每处理重复3次，得到对应乐果浓度的峰面积,再以峰面积为横坐标,乐果浓度为纵坐标,绘制标准曲线图(见图1)，得标准曲线方程。1.5培养条件对阴沟肠杆菌乐果降解效能的影响1.5.1实验设计[18]试验选用L16（44×23）正交表，对7因子进行实验，其中因子碳源、离子、乐果浓度及培养时间设置4个水平，培养温度、pH值、氮源等因子设置2个水平，具体见表1。表1正交试验因素水平表Table1Theformoforthogonaltest’design因子水平水平1水平2水平3水平4碳源:(g/L)果糖:(3)蔗糖:(3)葡萄糖:(3)淀粉:(3)离子:(Mmol/L)CuCl2:(10)FeCl2:(10)CdCl2:(2)ZnCl2:(2)乐果浓度(mg/L)50100200500培养时间(h)12243648培养温度(℃)3530pH值78氮源：(g/L)酵母：（3）蛋白胨：（3）1.5.2培养条件对阴沟肠杆菌乐果降解效能的影响[19-20]采用L16（44×23）正交因素水平表（见表3）中的要求配制各处理发酵液，每一规格为150ml的三角瓶分装30ml的发酵液，高压灭菌，在各处理中加入活化好的菌液各50ul，以未加菌的相应培养基为对照，每一处理2次重复。放置不同温度的摇床中培养，并在相应的培养时间内取样，此即为待测样品。吸取样品4mL，用真空抽滤器抽滤，回收滤液，在滤液中加氯化钠至饱和，再加12mL的二氯甲烷充分混匀，用分液漏斗萃取分离，取二氯甲烷部分，剩余的残液再用8ml的二氯甲烷二次提取，将两次所得二氯甲烷提取液用冷风吹干，再用乙氰定容至4ml，液相色谱分析(具体操作见1.4）,最后将测得的峰面积带入乐果的浓度和峰面积关系的标准曲线方程中，求出相应的浓度。1.6结果统计[21]农药降解率计算如下:降解率(%)＝（对照样品残留量—处理样品残留量）×100(%)/对照样品残4留量；用DPS数据处理系统对实验结果进行分析。2结果与分析2.1乐果的浓度和峰面积关系的标准曲线图从图1中可以看出，乐果在15.0mg·L-1至100.0mg·L-1的范围内，其浓度和峰面积呈现良好的线性关系，其标准曲线方程为y=0.0723x+0.2227，R2=0.9992。y=0.0723x+0.2227R2=0.999202040608010012002004006008001000120014001600峰面积乐果浓度（mg/L)图1乐果浓度和峰面积关系标准曲线Fig1.Therelationshipofstandardcurvebetweenconcentrationofdimethoateandpeakarea2.2培养条件对阴沟肠杆菌对果降解效能的影响及极差结果分析表2为16个处理的降解效果，处理1至处理16的降解率依次为38.70%、17.23%、2.92%、3.89%、58.09%、0%、1.10%、0.29%、49.47%、1.31%、3.00%、2.27%、9.76%、2.46%、26.52%、50.23%。从中可以看出，不同处理的降解率有很大的差别，最高的降解率如处理5，具体为：碳源：蔗糖、离子：CuCl2(10Mmol·L-1)、乐果浓度：100mg·L-1、培养时间36h、培养温度30℃、pH值8、氮源：酵母3g/L，达到58.904%，而最低的降解率如处理6为0，具体为：碳源：蔗糖、离子：FeCl2:(10Mmol·L-1)、乐果浓度：50mg·L-1、培养时间48h、培养温度30℃、pH值7、氮源：蛋白胨3g·L-1，其中处理3、4、6、7、8、10、11、12、14的降解率不到4%，可认为无降解作用，以上结果可说明培养条件因素等对菌降解乐果的影响作用很大，适合的条件可以促进菌对乐果的降解，反之将可能阻碍甚至阻止菌对乐