发酵工程的灭菌与除菌1.

灭菌与除菌1本章主要内容第一节染菌的危害第二节灭菌和除菌的基本原理第三节培养基和发酵设备的灭菌第四节空气除菌2第一节染菌的危害杂菌污染会产生哪些不良后果？为防止杂菌污染应采取哪些措施？3第二节灭菌和除菌的基本原理4第一节灭菌和除菌的基本原理一、常用灭菌方法5第一节灭菌和除菌的基本原理灭菌：是利用物理或化学的方法杀灭或去除物料或设备中所有的有生命的有机体的技术或工艺过程。消毒：是采用较温和的理化方法，仅杀死对人体有害的病原微生物的过程。(消毒只能杀死营养细胞而不能杀死芽孢或孢子。)除菌：是指用过滤方法除去空气或液体中所有的微生物及其孢子。6第一节灭菌和除菌的基本原理防腐：就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。如：低温，缺氧，干燥，高渗，高酸度，防腐剂。化疗即化学治疗：是利用具有高度选择毒力（即对病原微生物具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。7灭菌和除菌的基本原理发酵工业生产中常用的灭菌方法：①化学物质灭菌、②热灭菌③辐射灭菌④过滤介质除菌⑤臭氧（O3）灭菌89干热灭菌法火焰灼烧法热空气灭菌法湿热灭菌法常压灭菌高压灭菌巴氏消毒法煮沸消毒法间歇灭菌法高压—121℃15min；低压—105℃30min。二、高温湿热灭菌高温湿热灭菌是利用饱和蒸汽直接接触需要灭菌的物品以杀死微生物。湿热灭菌法是目前最常用的基本灭菌方法，一般的湿热灭菌条件为121℃(表压约0.1MPa)，维持20~30min。10湿热灭菌优点：①蒸汽来源方便，操作简单，价格低廉，本身无毒；②蒸汽有强的穿透力(能杀死耐热的芽孢杆菌)和很大的潜热，灭菌效果可靠；因此被广泛用于工业生产。1112杂菌的名称溫度/℃最低最适最高嗜热芽孢杆菌526575枯草芽孢杆菌1530~3755大肠杆菌1030~3743酵母菌0.525~3040几种杂菌适应温度范围能够杀死微生物的温度称为致死温度。13第一节灭菌和除菌的基本原理几种杂菌致死温度范围杂菌名称致死溫度/℃致死时间/min嗜热芽孢杆菌12012枯草芽孢杆菌1006~17大肠杆菌6010肺炎球菌565~7酵母菌50~605~10在致死温度下杀死全部微生物所需要的时间称为致死时间。不同的微生物的致死温度和致死时间也有差别。一般无芽孢的营养菌体在60℃保温l0min即可全部被杀死，而芽孢在100%下保温数十分钟乃至数小时才能被杀死，某些嗜热细菌在121℃下可耐受20-30min。1415热阻：指微生物在某一种特定条件下（主要指温度和加热方式）的致死时间。一般来说，灭菌是否彻底，是以能否杀死热阻大的芽孢杆菌为指标。相对热阻：是指某一微生物在某一条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。灭菌方式大肠杆菌细菌或酵母营养细胞细菌芽胞霉菌孢子噬菌体和病毒干热1110002~101湿热113×1062~101~5苯酚1110×1081~230甲醛112502~102紫外线112~55~1005~1016三、干热灭菌是指在干燥高温条件下，微生物细胞内的各种与温度有关的氧化反应速度迅速增加，使微生物的致死率迅速增高的过程。常用灭菌条件：160℃下保温1~2h。17四、辐射灭菌辐射灭菌是利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物。α射线、X射线、β射线、γ射线、紫外线、超声波等从理论上讲都能破坏蛋白质，破坏生物活性物质，从而起到杀菌作用。X射线的穿透力极强，但不经济，并且向四面八方辐射，不适于发酵生产使用。18紫外线波长为2100~3100Å的紫外线有灭菌作用，最常用的波长2537Å的紫外线。主要是与菌体核酸发生光化学反应而造成菌体死亡。紫外线对微生物菌体和芽胞均有杀灭作用，有高度致死效果。但紫外线的穿透力很低，仅适用于表面和局部空间灭菌，如台面、洁净室、更衣室等。现在，紫外线常与HVAC相结合用于气相循环消毒。HVAC是Heating,VentilationandAirConditioning的英文缩写，就是空气调节系统，是包含温度、湿度、空气清净度以及空气循环的控制系统。19五、化学物质灭菌原理：某些化学药剂能与微生物细胞中的某种成分产生化学反应，如使蛋白质变性、酶类失活、破坏细胞膜透性而具有杀菌或消毒的作用。常用的化学药剂：甲醛、氯(或次氯酸钠)、高锰酸钾、环氧乙烷、苯酚、季氨盐(如新洁尔灭)、氯化汞等。适用情况：①培养基里含有蛋白质等营养物质亦易与上述化学物质发生化学反应，②同时药物加入培养基之后很难除掉。适合于局部空间或某些器具的消毒，但不适合用于培养基的灭菌。20六、静电除菌静电除菌是利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌的目的。----带微粒的空气电离部分除尘部分清洁空气5000v10000v图4-2静电除尘器装置图2122空气进空气出钢丝电晕电极钢管沉淀电极—++优点：阻力小，约0.01MPa；除水、除油的效果好耗电少，每处理1000m3的空气每小时仅耗电0.2~0.8KW。缺点：静电除菌效果不是很高，一般在85~99%之间。23七、臭氧（O3）灭菌臭氧是一种强氧化剂，灭菌过程属生物化学氧化反应。原理是：①臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧气（O2）和单个氧原子（O）；后者具有极强的氧化作用，能氧化分解细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶，从而破坏其细胞膜，将它杀死；②直接与细菌、病毒作用，破坏它们的细胞器和DNA、RNA，使细菌的新陈代谢受阻，导致细菌死亡；③作用于细胞外膜的脂蛋白和内部的脂多糖，使细菌发生通透性畸变而溶解死亡。24我国在GMP验证过程中人们大力推荐臭氧灭菌方法。臭氧灭菌有许多特点：①O3为气体，能迅速弥漫到整个灭菌空间，灭菌无死角，浓度分布均匀。②臭氧灭菌为溶菌级方法，杀菌彻底。杀菌能力与过氧乙酸相当，高于其它消毒剂。③杀菌广谱，可杀灭细菌繁殖体和芽孢、病毒、真菌等，并可破坏肉毒杆菌毒素。另外，O3对霉菌也有极强的杀灭作用。④臭氧制备是利用我们周围的大气制取(现有成型产品：臭氧发生器），现制现用，不需储藏设施，节省原料储储所需的占地面积。⑤臭氧分解形成的单个氧原子（O）则会自行重新结合成为普通氧分子（O2），不存在任何有毒残留物，没有二次污染，故称无污染消毒剂(绿色消毒剂)。25臭氧灭菌在药品生产中具有广泛的用途。①对管道容器的灭菌；②与HVAC相结合，利用中央空调净化系统对洁净区的灭菌；③对原辅助材料和工作器具的灭菌；④对密闭空间的灭菌；⑤对药厂用水的灭菌处理。26八、介质过滤除菌工业上主要用于热敏性物质(氨水、丙醇等)和空气的除菌。按过滤除菌机制不同而分为27绝对过滤深层过滤1、绝对过滤绝对过滤最常用的过滤材料是微孔滤膜。选择孔径为0.2μm或0.45μm的滤膜就可达到除菌的目的。对动物细胞血清培养基选用0.1μm孔径的滤膜来除去支原体的污染。滤膜材料可以是醋酸纤维素、尼龙、聚醚砜、聚丙烯等。绝对过滤易于控制过滤后空气质量，节约能量和时间，操作简便。282、深层过滤（介质过滤）空气中的微生物大多数是细菌和芽孢，还有一定数量的霉菌、酵母和病毒。细菌的大小为零点几微米至几微米，这些微生物在空气中极少单独游离存在，基本都是附着在灰尘、液滴等微粒的表面上。29微生物细胞：宽×长/μm孢子：宽×长/μm产气杆菌1.0~1.5×1.0~2.5蜡状芽孢杆菌1.3~2.0×8.1~25.8普通变形杆菌0.5~1.0×1.0~3.0地衣芽孢杆菌0.5~0.7×1.8~3.3巨大芽孢杆菌0.9~2.1×2.0~10.00.6~1.2×0.9~1.7蕈状芽孢杆菌0.6~1.6×1.6~13.6枯草芽孢杆菌0.5~1.1×1.6~4.80.5~1.0×0.9~1.8金黄色小球菌0.5~1.0×0.5~1.0酵母菌3.0~5.0×5.0~19.0病毒0.0015~0.225×0.0015~0.28霉状分枝杆菌0.6~1.6×1.6~13.60.8~1.2×0.8~1.830介质过滤除菌的原理与绝对过滤除菌的原理是不同的，介质过滤介质间的空隙往往远大于颗粒直径。如棉花纤维直径一般为16~20μm，充填系数为8%时，棉花纤维间形成的空隙为20~50μm。球菌的直径一般在0.5~2μm，杆菌一般长1-5μm，宽0.5~lμm。31因为过滤介质层是由无数的纤维纵横交错组成的，形成的网格阻碍气流前进，使气流无数次地改变运动速度和运动方向，这些改变引起空气中微粒的惯性冲击、拦截、扩散、重力沉降和静电吸附等作用，于是大大增加了微粒被纤维捕获的几率。32(1)惯性冲击截留作用：撞上去被吸附；这种惯性冲击作用的程度取决于微粒的动能、纤维阻力、气流速度。惯性冲击作用的强弱与气流流速成正比，空气流速大时，惯性冲击就起主导作用。33(2)拦截截留作用：速度太慢动能不足被吸附；当气流速度较低时，微粒的运动轨迹与空气流线相似。气流改变力向时，微粒的流向随之改变，与纤维表面接触时就被捕集，这种作用叫拦截。34θ90o(3)布朗扩散截留作用：不规则运动增强了接触机会；直径很小(＜1μm)的微粒在很慢的气流中能产生不规则的直线运动称为布朗运动。结果使较小的微粒聚集成为较大的微粒，增加了与纤维接触的机会，当与纤维接触时就被捕集，这种作用叫做扩散。35(4)重力沉降作用：对大颗粒有效；空气中的灰尘微粒所受的重力大于气流对它的支持力时，微粒就会沉降。直径50μm以上的颗粒沉降作用比较显著，小颗粒只有在气流速度很慢时才有沉降作用。36(5)静电吸引作用：异性相吸。空气在非导体物质中间进行相对运动时，由于摩擦会产生诱导电荷，特别是纤维更为显著。悬浮在空气中的微生物颗粒大多带有不同的电荷。有人曾测定，大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌约有75%的孢子带负电荷，15%的孢子带正电荷，其余10%的孢子是电中性的。37在过滤除菌中，有时很难分辨上述各种机理各自所做出贡献的大小，多是五种作用的综合结果。随着参数的变化，各种作用之间有着复杂的关系，目前还未能作准确的理论计算。一般认为惯性冲击、拦截和布朗扩散运动的作用较大，而重力沉降作用和静电吸引的作用则很小。38VcVc空气过滤后的微粒数与过滤前的微粒数的比值称为穿透率P，则P=——式中N0—过滤前空气中的微粒含量(个)；Nt—过滤后空气中的微粒含量(个)。介质过滤效率η是指被捕集的微粒数与空气中原有的微粒数的比值，是衡量过滤设备过滤能力的指标。η=———=1-——=1-P39NtN0N0-NtN0NtN01）纤维直径：在其他条件相同时，介质纤维直径越小，过滤效率越高。2）介质的填充厚度与密度：对于相同的介质，填充厚度和密度越大则过滤效率越高，但同时流速也越小。3）空气流速：在空气流速很低时，过滤效率随气流速度增加而降低；当气流速度增加到临界值后，过滤效率随气流速度增加而提高；气流速度高达一定值后，过滤效率再降低，所以要通过实验方法来摸索最适流速。40培养基的灭菌1.分批灭菌2.连续灭菌发酵罐的灭菌1.空消2.实消物料管路的灭菌倒种管路的灭菌补料液的灭菌消沫剂的灭菌41第二节培养基和发酵设备的灭菌一、温度和时间对培养基灭菌的影响用湿热灭菌方法对培养基灭菌，在杀灭微生物的同时，也会对营养成分造成破坏。在高压加热的条件下，会使糖液焦化变色、维生素失活、醛糖与氨基化合物反应、不饱和醛聚合、一些化合物水解等。灭菌温度（˚C）达到灭菌程度的时间（min）维生素B1的损失（%）100110120130140150843757.60.8510.1070.01599.998927103142一、温度和时间对培养基灭菌的影响嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死亡程度为N/N0=10-16时，灭菌温度对维生素B1破坏的影响灭菌温度、灭菌时间和维生素B1破坏量的比较灭菌温度/℃灭菌时间/minB1破坏量/%10040099.3110306711515501204271300.581400.0821500.01143二、影响培养基灭菌的其它因素1、培养基成分在固形物含量高的情况下，灭菌温度要高些