发酵工艺学

1、菌种代谢生理及其调控的分子生物学机制1）初级代谢产物：通常把微生物产生的对自身生长繁殖必需的物质，而产生这些物质的代谢体系或过程称初级代谢。具体分为：分解代谢体系和合成代谢体系。次级代谢产物：指生物体合成，但对其自身的生长、繁殖和发育并没有影响的但对产生菌的生存具有一定作用的一类物质。2）代谢调控机制①酶合成调控诱导、阻遏（末端产物阻遏、分解代谢阻遏）。②酶活性的调节激活、抑制（反馈抑制，变构酶）2、发酵工业菌种改良1）目的：提高目标产物产量；提高产品质量，减少副产物；改良菌种性状，改善发酵过程；改造合成途径，获得高产新产品3、菌种选育的一般方法：自然选育、诱变育种（高效定向筛选）、杂交育种、基因工程育种。自然选育、诱变育种是利用基因突变获得优良菌种，能改良菌种遗传特性；自然选育可达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高发酵产量的目的；杂交育种、基因工程育种是通过DNA重组获得优良菌种，能改变菌种遗传特性。4、诱变育种（代谢调控育种）①基本过程：选择合适的出发菌株；制备待处理菌悬液、诱变、筛选、保藏和扩大试验。②工作要点：选择简便有效诱变剂、挑选优良的出发菌株、选用最适剂量：低剂量诱变剂更有利于高产菌株的稳定、处理单孢子悬液应均匀、充分利用复合处理的协同效应、设计采用高效定向筛选方案。5、细胞工程育种：采用杂交、接合、转化、转导的方法，将遗传物质进行交换、重组。6、基于代谢调节的育种技术：组成型突变株的选育、抗分解调节突变株的选育（碳源、氮源）、抗反馈调节突变株的选育、细胞膜透性突变株的选育。7、组成型突变株的筛选：限量诱导物恒化培养、循环培养。8、营养缺陷性突变株的筛选：逐个检出法、影印平板法。9、基因工程育种步骤：目标DNA片段的获得、与载体DNA分子的连接、重组DNA分子引入宿主细胞、重组体的选择与鉴定。10、培养基的组分：碳源、氮源、无机盐及微量元素、水、生长调节物质。11、用作碳源的物质及特点：糖类（葡萄糖、淀粉、蜜糖）、油脂、有机酸、低碳醇1）糖类：①葡萄糖：最易利用，几乎所有微生物都能利用；葡萄糖常作为培养基的一种主要成分，并且作为加速微生物生长的一种有效糖。②淀粉：需经胞外酶水解成单糖后再被吸收利用。2）油和脂肪：释放出比糖代谢更多的能量，需要供给更多的溶解氧3）有机酸：会使PH上升12、培养基的类型：斜面培养基、种子培养基、发酵培养基。13、培养基成分选择的原则：菌体的同化能力、培养基对菌体的阻遏和诱导、碳氮比对菌体代谢调节的重要性、pH对不同菌体代谢的影响。14、培养基设计与优化的大致步骤：1）根据前人的经验和培养基配制的基本理论，初步确定可能的成分2）通过单因子实验确定最为适宜的培养基成分3）通过多因子实验确定各成分的最适浓度15、培养基优化的方法：①根据以前的经验以及在培养基成分确定时必须考虑的一些问题，初步确定可能的培养基组分。②通过单因子优化实验确定最为适宜的各个培养基组分及其最适浓度。③最后通过多因子实验进一步优化培养基的各种成分及其最适浓度。16、染菌的危害：消耗营养、合成新产物、菌体自溶、发粘等造成分离困难、改变pH、分解目标产物、细菌发酵污染噬菌体导致发酵失败。17、染菌的检查和判断：显微镜检查法、平板划线培养或斜面培养检查法、噬菌体、肉汤培养检查法18、染菌的防治：种子带菌的防治、过滤空气带菌的防治、设备渗漏的防治。19、污染的原因：灭菌不彻底、操作不当造成染菌、噬菌体染菌20、发酵工业的无菌技术：湿热灭菌法、过滤除菌法、干热灭菌法、射线灭菌法、化学药剂灭菌法、火焰灭菌法。21、湿热灭菌的原理：对数残留定律：-dN/dt=kN，lnNt/No=-kt，t=2.303lgNo/Nt/kN是残留的活菌数，t受热时间，k比死亡速率常数。K是判断微生物受热死亡的难易程度的基本依据，k值越小，微生物越耐热。22、影响培养基灭菌的因素：培养基的成分、培养基的PH、培养基的物理状态、泡沫、培养基中微生物的数量。23、分批灭菌的工艺流程：开始灭菌时，应排放夹套或蛇管中的冷水，开启排气管阀，夹套内通入蒸汽，当发酵罐内的空气升至70℃时开始由空气过滤器、取样管和放料管通入蒸汽，当发酵罐内温度达到120℃时，压力达到1×105pa时，灭菌进入保温阶段，保温阶段，凡液面以下各管道都应通蒸汽，液面上其余各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力、温度恒定直到保温结束。依次关闭各排汽、进汽阀门，并通过空气过滤器迅速向罐内通入无菌空气，维持发酵罐降温过程的压力，夹套或蛇管中通冷水，使培养基降温到所需温度。24、连续灭菌的优点：适用于大型罐；灭菌时间短，营养成分破坏少；发酵罐利用率高；蒸汽负荷均衡；采用板式换热器时，可节约大量能量；适宜采用自动控制，劳动强度小；可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。25、连续培养加热到保温温度后很快被冷却原因：有利于减少营养物质的破坏，提高发酵产率。26、相对湿度：φ=pw/ps，Φ2=Φ1(ps1/ps2)×p2/p1(p75)27、种子的制备步骤：斜面培养基中活化；扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完成实验室种子制备；一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩大级数，完成生产车间种子制备；种子转种至发酵罐28、种子罐的级数确定：根据菌种生长特性、孢子发芽和繁殖速度及所采用的发酵罐容积来确定29、影响种子质量的因素：原材料质量、培养温度、湿度、通气和搅拌、斜面冷藏时间、培养基、PH。30、分批发酵过程中。微生物的生长通常要经历延滞期、对数生长期、衰减期、稳定期和衰亡期31、微生物生长特性通常以单位细胞浓度或细胞数量在单位时间内的增加量来表示（μn、μ）lnXt=lnXo+μt或lnNt=lnNo+μntdtdXX1dtdNNn1tteXX0ttneNN032、各时期的特点：延滞期：微生物并未增值、细胞数目几乎保持不变的一段时间。对数生长期，微生物的生长速率逐渐增加，逐渐达到最大生长速率。稳定期，微生物处于生长和死亡的动态平衡，发酵体系的净生长率为零。衰亡期是发酵罐内的营养物质耗尽，对生长有害的代谢物在发酵液中大量积累的时期。33、Monod模型Ks（mg/L）34、Ks、m、μ、μm、YX/S、Yp/s、YG、YP、qs、qp及其测定方法（直接或间接计算），它们分别与哪些因素相关？Ks——底物亲和常数，其数值相当于μ处于μm一半时的底物浓度，表明微生物对该底物的亲和力Ks与μ成反比，Ks越大，表明微生物对该底物的亲和力越低，比生长速率越小μ——以细胞浓度表示的比生长速率μm——最大比生长速率，即对数生长期的比生长速率tSKtSmsKs—底物亲和常数，等于处于1/2μm时的底物浓度，表征微生物对底物的亲和力，两者成反比。X—细胞浓度（g/L）；N—细胞个数；t—生长时间；X0、Xt—初始微生物浓度和t时细胞浓度；N0、Nt—初始细胞个数和t时细胞个数；μ—以细胞浓度表示的比生长速率；μn—以细胞数量表示的比生长速率。m——维持细胞结构和生命活动所需能量的细胞维持系数，g基质/（g菌体•s）或s-1YX/S——对底物总消耗而言的细胞得率，即细胞的表观得率Yp/s——对底物总消耗而言的产物得率，即产物表观得率YG——专一性用于生长的底物消耗转化的细胞得率，即专一性（本征）细胞得率YP——专一性产物得率（转化率）qs——底物比消耗速率，即单位质量细胞在单位时间内消耗底物的量qp——产物比生成速率，即单位质量细胞在单位时间内生成产物的量35、根据这些参数及相应的动力学方程可以优化发酵条件（pH、T、DO2、底物类型及浓度等）。36、特定的微生物，特定条件，μm、Ks是定值，体现菌种的特性；微生物不同，μm、Ks不同。同种微生物，在不同类型S中，μm、Ks值也不同。Ks↑，亲和力↓，微生物对基质越不敏感，生长慢，μm↓；反之，Ks↓，μm↑37、微生物生长与产物合成存在以下三种关系：与生长相关→生长偶联型：与生长部分相关→生长部分偶联型：与生长不相关→无关联：38、连续发酵动力学：稀释率D=F/V(h-1)F—流量（m3/h）V—培养液体积稳定时，单级连续培养两个稳态方程：39、临界稀释率Dc：导致菌体开始从系统中洗出时的稀释率。当限制性底物初始浓度为S0时，临界稀释率Dc为40、摄氧率（耗氧速率OUR）γ：单位体积培养液（含干菌体质量X）在单位时间内消耗发酵液中溶解氧的量。单位：mmolO2/（)γ=QO2·X。X——以干重表示的细胞浓度，kg(干重)/m341、影响微生物耗氧的主要因素：1）、微生物本身遗传特征的影响，如ko↑，QO2↓；2）、培养基的成分和浓度，碳源种类：耗氧速率：油脂或烃类葡萄糖蔗糖乳糖；培养基浓度浓度大，QO2↑，浓度小，QO2↓3）、菌龄的影响一般幼龄菌QO2大,晚龄菌QO2小4）、发酵条件的影响，pH值→通过酶活来影响耗氧特征；温度→通过酶活及溶氧来影响耗氧特征：T↑，DO2↓；5）、代谢类型(发酵类型)的影响，若产物通过TCA循环获取,则QO2高,耗氧量大，若产物通过EMP途径获取,则QO2低,耗氧量小。42、氧的传质阻力：气膜传递阻力1/kG；气液界面传递阻力1/kI；液膜传递阻力1/kL；液相传递阻力1/kLB。细胞或细胞团表面的液膜阻力1/kLC；固液界面传递阻力1/kIS；细胞团内的传递阻力1/kA；细胞膜、细胞壁阻力1/kW；反应阻力1/kR。43、氧传递过程达到稳态时，总的传质速率与串联的各步传氧速率相等，则此时通过单位接触界面面积的氧的传递速率为：nO2—单位接触界面的氧传递速率（OTR），P、Pi—气相中和气、液界面处氧的分压MPa，CL、Ci—液相中和气、液界面处氧的浓度，kG—气膜传质系数，kL—液膜传质系数，m/h44、若改用总传质系数和总推动力，则在稳定状态时，KG—以氧分压差为总推动力的总传质系数，KL—以氧浓度差为总推动力的总传质系数，m/s，P*—与液相中氧浓度C相平衡时氧的分压，Pa，C*—与气相中氧分压P达平衡时氧的浓度，mol/m345、氧传递方程：定义：体积传氧速率OTR单位体积的比表面积a，单位面积的传氧速在单位体积培养液中，氧的传质速率（氧传递方程）为OTR—单位体积培养液中氧的传递速率，KLa—以浓度差为推动力的体积溶氧系数，KGa—以分压差为推动力的体积溶氧系数。0dtdx此时µ=D（单级连续发酵重要特征）。SSYxDSX0/00SKSDSmC)(32hmmmolOLLiGiOkCCkPPn112阻力推动力)CC(K)PP(KnL*L*GO2)(1)()(***PPHaKPPaKCCaKOTRLGLL45、影响氧传递的因素：（1）影响推动力的因素：温度、溶质、溶剂、氧分压。（2）影响KLa的主要因素：①设备参数②操作条件③发酵液的性质46、通气搅拌对KLa的影响：转速N↑→PG↑→KLa↑在通气量Qg较低时,Qg↑→Ws↑→KLa↑47、微生物生长中呼吸强度和摄氧率变化的一般规律及影响因素各有哪些？①微生物本身遗传特征的影响。②培养基的成分和浓度。③菌龄④发酵条件⑤代谢类型48、KLa的测定原理与方法：亚硫酸盐氧化法、取样极谱法、物料衡算法、动态法、复膜电极法。49、溶解氧CL的测定原理与方法：化学法、极谱法、复膜氧电极法。50、摄氧率γ的测定方法：瓦氏呼吸仪法、物料衡算、氧电极法。51、发酵过程控制的一般步骤：①确定能反映发酵过程变化的各种参数/因素及其检测方法②确定这些参数/因素的影响机制及其最适水平或范围③建立模型定量描述各参数之间随时间变化的关系④通过计算机在线检测和控制，验证各种控制模型的可行性及其适用范围，实现发酵过程优化控制52、代谢参数按性质可分为三类：生物参数：菌体浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、摄氧率、菌丝形态、关键酶活力等。物理参数：温度、搅拌转速、罐压、空气流量、溶解氧、尾气氧/二氧化碳浓度、表观粘度、发酵液密度等。化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、