发酵工程大题缩1

8.解决工程菌不稳定性的对策？答：工程菌稳定与否，与重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件等因素有关。⑴组建合适载体，在质粒构建时，插入一段特殊的DNA片段或基因以使宿主细胞分裂时，质粒能够较稳定的遗传到子代细胞中。⑵选择适当宿主。重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞遗传特性的影响，在选择宿主时，必须确定其遗传特点。⑶施加选择压力。从遗传学来说，选择即利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能生长。a.抗生素添加法，通常在重组质粒上含有抗药性基因。将含有抗药性基因的重组质粒转入不耐药的宿主细胞后，克隆菌也获得了抗药性。在克隆发酵时，于培养基中加入适量的相应抗生素，可阻止丢失了重组质粒的非生产菌的生长。b.抗生素依赖变异法。通过诱变产生的抗生素依赖性突变株，只有在该抗生素存在时宿主细胞才能生长，或其体内含有该抗生素非依赖性基因，使得克隆菌能在不含抗生素的培养基生长。c.营养缺陷法。⑷控制基因过量表达，提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，外源基因表达水平越高，重组质粒越不稳定，在发酵前期控制温度使外源基因不过量表达，重组质粒稳定的遗传，到后期通过提高温度是外源基因高效表达。⑸控制培养条件，培养基组成、培养温度、菌体的比生长速率三种环境条件对克隆菌质粒的稳定性和表达效率影响尤为重要。选择最合适的培养条件是进行工业化生产的关键步骤。⑹在构建质粒时，插入一段能改良宿主细胞生长速率的特殊的DNA片段，也能起到稳定质粒的效果。⑺可转移性因子会促进插入和丢失的出现，因此所使用的质粒不应带有可转移因子。⑻冗长的DNA对宿主细胞是一种负担，并会增加其在体内进行DNA的重排，所以尽可能将质粒上的不需要的DNA部分除去。⑼固定化重组菌以提高基因工程菌的稳定性。6.发酵过程中通气产生大量泡沫有哪些副作用？答：⑴降低了发酵罐的装料系数，发酵罐的装料系数一般取0.7左右。⑵增加了菌群的非均一性，由于泡沫高低的变化和不同生长周期的微生物随泡沫漂浮，或黏附在罐壁上，使这部分菌有时在气相环境中生长，引起菌的分化，甚至自溶，从而影响了菌群的整体效果⑶增加了污染杂菌的机会，发酵液溅到轴封处，容易染菌。⑷大量起泡，控制不及时，会引起逃液。⑸消泡剂的加入有时会影响发酵或给提炼工序带来麻烦。1.工业微生物在筛选所需菌株时，需要考虑的重要指标有哪些？答：⑴菌的营养特征；⑵菌的生长温度应选择温度高于40℃的菌种。这样可以大大降低大规模发酵的冷却成本。⑶菌对所采用的设备和生产过程的适应性。⑷菌的稳定性。⑸菌的产物得率和产物在培养液中的浓度。（越高越好）⑹容易从培养液中回收产物。2.大规模发酵培养基的共同特点有哪些？答：⑴培养基能够满足产物最经济的合成；⑵发酵后形成的副产物尽可能的少；⑶培养基的原料应因地制宜、价格低廉，且性能稳定、资源丰富，便于采购运输，能保证生产上的供应；⑷所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。9.培养基成分选择的原则有哪些？答：⑴菌体旳同化能力,微生物能够利用复杂的大分子是由于微生物能够分泌各种各样的水解酶类，在体外将大分子求解为微生物能够直接利用的小分子物质。由于微生物来源和种类的不同，所能分泌的水解酶系是不一样的。因此，在考虑培养基成分选择的时候，必须充分考虑菌种的同化能力，从而保证所选用的培养基成分是微生物能够利用的。在碳源和氮源的选取时特别要注意。许多碳源和氮源都是复杂的有机大分子，用这类原料作为培养基，微生物必须具备分泌胞外淀粉酶和蛋白酶的能力，但不是所有的微生物能够利用的。⑵代谢的阻遏和诱导,在配制培养基考虑碳源和氮源时，应根据微生物的特性和培养基的目的，注意快速利用的碳（氮）源和慢速利用的碳（氮）源的相互配合，发挥各自的优势，避其所短。对于快速利用的碳源葡萄糖来讲，当菌体利用葡萄糖时产生的分解代谢产物会阻遏或抑制某些产物合成所需的酶系的形成或酶的活性，即发生葡萄糖效应。⑶合适的C、N比,培养基中碳氮比对微生物生长繁殖和产物合成的影响极为显著。氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物积累；氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量；碳源过多则容易形成较低的pH；碳源不足则容易引起菌体的衰老和自溶。另外。碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。⑷pH的要求微生物在利用营养物质后，由于酸碱物质积累或代谢酸碱物质的形成，会造成培养体系PH的波动。发酵过程中调节PH的方式一般不直接用酸碱来调节，酸碱虽然可以调节PH，但不能解决引起PH变化的原因，效果不明显，治标不治本。要保证发酵过程中pH能满足工艺的要求，合理配制培养基是成功的决定因素。因而在配制培养基选取营养成分时，除了考虑营养的需求外，也要考虑其代谢后代对培养体系pH缓冲体系的贡献，从而保证整个发酵过程中pH能够处于较为适宜的状态。3.简述培养基的设计过程？答：⑴根据前人的经验和培养基成分确定时，一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分。⑵通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分。⑶当培养基成分确定后，剩下的问题就是各个成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少试验次数，常采用一些合理的实验设计方法。10.培养基设计时需要注意哪些问题？答：⑴原料及设备的预处理。原料：a.有些谷物最好先去皮，一方面可以防止皮壳中有害物质带入发酵醪，影响微生物的生长和产物的形成；另一方面大量的皮壳占去一定体积，降低了设备的利用率，且堵塞管道，增加流动阻力。b.使用糖蜜时，由于糖蜜中含有大量的无机盐、胶体物质和灰分，对于有些产品的生产，必须进行预处理。设备：工业上一般使用铁制的发酵罐，这种发酵罐内的溶液即使不加任何含铁的化合物，其铁离子浓度也很高。有些产品对铁离子非常敏感。新发酵罐或腐蚀的发酵罐会造成铁离子的浓度过高，目前常用的处理方法是在罐内壁涂生漆或耐热环氧树脂作保护剂以防铁离子的脱落。⑵原材料的质量。对于绝大部分产品培养基成分中关键的是调控因子常常是一些微量物质，（如碳源、氮源等），其质量（包括成分、含量）的稳定性是获得连续、稳定高产的关键。在选择培养基多用的有机氮源时，特别要注意原料的来源、加工方法和有效成分的含量以及储存方法，有机氮源大部分为农副产品，其中所含的成分收产地、加工、储存等影响较大。⑶发酵特性的影响。培养基中各成分的含量往往是根据经验和摇瓶或小罐试验结果来决定的，但在大规模发酵是要综合考虑。⑷灭菌。发酵培养基都要经过灭菌，发酵培养基灭菌的基本方法是是热蒸汽灭菌法，灭菌同时必然存在营养物质的损失，由于灭菌条件的差异造成培养基成分的差异，这一点常造成放大的失败和发酵结果波动的。因此大规模发酵中应尽可能采用连续灭菌的操作，保证培养条件的稳定是保证发酵稳定的前提。有时避免营养物质在加热的条件下，相互作用，可以将营养物质分开消毒。有些物质由于挥发和对热非常敏感，就不能采用湿热的灭菌方法。如氨水的灭菌采用过滤除菌的方法进行灭菌。7.简述诱变育种中，应注意哪些问题？答：⑴选择好的出发菌株。其标准是时间短、产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度广，在确定诱变剂的使用及筛选条件。⑵复合诱变因素的使用。野生型菌株单一诱变因素有时也能取得好的效果，老菌株单一诱变因素重复使用突变的效果不高，可使用复合因素来扩大突变幅度，提高诱变效果⑶剂量选择。剂量的选择和诱变因素的使用都随不同菌种而异，变异率取决于诱变剂量，变异率和致死率之间有一定关系，因此可用致死率作为选择适宜剂量的依据。一般诱变效应随剂量的增大而提高，但达到一定剂量后，再增加剂量反而会使诱变率下降。⑷变异菌株的筛选。不同菌种表现的变异形式不同，因此挑选菌株一般从菌株形态、变异类型着手，根据那些与产量有关的特性，挑选典型菌株进行发酵和鉴定，以确定各种类型与产量之间的关系。⑸高产菌株的获得需要筛选条件的配合。忽略这一点，就不可能挑选出高产菌株。13动物细胞生物反应器的细胞培养模式有哪几种？其操作方式和特征分别如何？答：主要有分批培养、流加培养、半连续培养、连续培养、连续培养等五种。⑴分批培养，分批培养是指将细胞和培养液一次性装入反应器内，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成，经过一段时间反应后，将整个反应系取出。特征：细胞所处环境时刻发生变化，不能使细胞自始至终处于最优条件下，在这个意义上并不是一种好的操作。但由于操作简单，容易掌握，因而又是最常用的操作方式。⑵流加培养，流加培养是指将一定量的培养液装入反应器，在适宜条件下接种细胞，进行培，细胞不断生长，产物也不断形成。随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分不断补充至反应器内，使细胞进一步生长代谢，到反应终止时取出整个反应系。特征：能够调节环境中营养物质的浓度，以避免某种营养成分的初始浓度过高而出现底物抑制现象，能防止某些限制性营养成分在培养过程中被消耗尽而影响细胞的生长和产物的形成，这是与分批培养的明显不同。⑶半连续培养，半连续培养（又称反复分批、换液培养）是指在分批培养的基础上不全部取出反应系，剩余部分重新补充新的营养成分，再按分批培养的方式操作。特征：可以反复收获培养液，对于培养基因工程动物细胞分泌有用产物或病毒增殖过程比较实用，尤其是微载体培养体系更是如此。反应器内培养液的总体积保持不变。⑷连续培养，连续培养是指将培养细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养，一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应液不断地取出，反应处于一种恒定状态。特征：可以控制细胞所处的环境条件长时间的稳定，可以使细胞维持在优化状态下，促进细胞生长和产物形成，可以连续不断地收获产物，并提高细胞密度。此外，对于细胞的胜利或代谢规律的研究是一种重要手段。在生产中被应用于培养非贴壁依赖性细胞。⑸灌注培养，灌注培养是指细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应液不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。特征：当高密度培养动物细胞时，必须保证补充细胞足够的营养以及去除有害的代谢废物。在半连续培养中，可以采用取出部分用过的培养基和加入新鲜的培养基的办法来实现，这种分批部分换液办法的缺点在于当细胞密度达到一定量时，代谢废物的浓度可能在换液前就达到产生抑制作用的程度。降低代谢产物的有效方法就是用新鲜的培养基进行灌注，通过调节灌注速率可以吧培养过程保持在稳定的、代谢废物低于抑制水平的状态。5.菌株作为种子的准则有哪些？答：⑴菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短⑵生理性状稳定⑶菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求⑷无杂菌污染⑸保持稳定的生产能力4.简述发酵生产确保纯种培养的措施有哪些？答：⑴设备灭菌并确保无泄漏⑵所用培养基必须灭菌⑶通入的气体（如好氧培养中的空气）应经除菌处理⑷种子无污染确保纯种⑸培养过程中加入的物料应经灭菌处理，并在处理过程中确保无污染，这点在连续培养中尤为重要14．发酵染菌的途径有哪些？答：⑴种子包括进罐前菌种复苏、扩大培养等阶段出问题。种子带菌的检查可以从菌种室保藏的菌种、斜面、摇瓶直到种子罐。保藏菌种定期作复壮、单孢子分离和纯种培养；斜面、摇瓶和种子罐作无菌试验，显微镜观察菌形是否正常。⑵培养基的配置和灭菌不彻底。培养基没消透的原因有很多，蒸汽压力或灭菌时间不够，培养基配料未混合均匀，存在结块现象，设备没清洗干净等。⑶设备室特别是空气除菌不彻底和过程控制操作上的疏漏。设备方面也会遇到很多问题，夹层或盘管、轴封和管道的渗漏，空气除菌效果差，管道安装不合格，存在死角等是染菌的重要原因。12.影响种子质量的因素有哪些？答：⑴原材料质量,生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量的波动，起主要作用是其中无机离子含量不同。如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。⑵培养条件,温度：温度对多数品种斜面孢子质量有显著影响。湿度：面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的影响。通气量：在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的