变形梯度凝胶电泳

变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳（denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE），是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。具体而言，就是将特定的双链DNA片段在含有从低到高的线性变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，随着电泳的进行，DNA片段向高浓度变性剂方向迁移，当它到达其变性要求的最低浓度变性剂处，双链DNA形成部分解链状态，这就导致其迁移速率变慢。由于这种变性具有序列特异性，因此DGGE能将同样大小的DNA片段很理想地分开，它是一种很有用的分子标记方法。DGGE最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究，并证实了这种技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，现已广泛应用于生物多样性调查、亲缘关系鉴定、基因突变检测等多个领域。这一技术能够提供群落中优势种类信息，并同时分析多个样品，具有可重复和操作简单等特点，适合于调查种群的时空变化。而且可通过对条带的序列分析或与特异性探针杂交分析，鉴定群落组成。DGGE通过逐渐增加的化学变性剂线性浓度梯度，可以把长度相同但只有一个碱基不同的DNA片段分离。作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：（1）突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上。（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。（4）操作简便、快速。DGGE一般在24小时内即可获得结果。（5）重复性好。但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。DGGE的基本原理及方法：DGGE不是将分子量不同的DNA分开，而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同，将序列不同的DNA分开。该方法的原理是根据DNA的解链特性，不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同，混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时，相对应的DNA发生解链变性，导致电泳迁移速率降低。由于泳动受阻DNA分子在凝胶中的停留位置不同，从而使不同DNA分子得以分离。根据变性剂梯度方向的不同，DGGE可分为：垂直DGGE，即变性剂梯度与电场方向垂直，常用于试验决定分离型、野生型和变异型的最佳变性剂梯度范围；平行DGGE，其变性剂的梯度和电场方向平行，主要用于解链范围明确的DNA片段的检测。DGGE对微生态的分析一般包括三个步骤：核酸提取、16SrRNA序列的PCR扩增以及DGGE指纹图谱分析。有些学者通过克隆、测序建立微生物区系的16SrRNA/DNA文库，通过系统发育分析，建立进化树，从而获得微生物多样性信息，但这种方法相对于指纹图谱技术来说，费时费力，价格也相对昂贵。核酸提取：微生物总DNA的提取是整个分子生物学技术的基础，是否能获得具有代表性的总DNA样品将决定后续分析的可行性。一般认为微生物提取总DNA的方法分为细胞裂解和核酸抽提两个步骤。细胞裂解有三种：机械法、化学法和酶法。机械法包括玻璃珠法、超声波法、冻融法等；化学法包括加入SDS、苯酚等；酶法包括加入裂解酶、蛋白酶K和溶解酶等。而许多研究者用其中两种或三种方法进行组合，发现组合后提取总DNA的效果较好。Stahl等（1988）在含有SDS和酚的体系中加入适量的玻璃微珠，机械法裂解瘤胃样品中的菌体细胞。Zhu等用酶法和玻璃珠相结合的方法提取鸡盲肠内容物的微生物总DNA。核酸抽提一般用酚-氯仿-异戊醇抽提，这种方法对去除杂蛋白有良好的效果。Reichardt等（1994）认为，CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）法也是常用的方法，不需要贵重仪器，操作较为简单，能广泛适用于各种植物的核酸提取，纯度也能满足许多分子生物学操作的要求，所以使用日趋广泛。16SrRNA基因序列的PCR扩增：细菌按沉降系数分为5S、16S和23S三种，16SrRNA基因是细菌染色体上编码该rRNA的相应DNA系列。16SrRNA基因序列全长1540bp，有保守区和可变区之分，每种细菌的保守区都是相同的，能反映生物种类的亲缘关系，为系统发育重建提供线索；可变区因细菌种类而异，通过保守区设计引物，扩增出可变区，就可以得知微生物多样性信息。大多数情况下，可根据16SrRNAV3区和V6-V8区设计细菌特异性引物进行PCR扩增，有时为了更加准确得获得微生物多样性的信息，可先通过细菌16SrRNA序列全长通用引物进行PCR扩增，再对V3或V6-V8区进行扩增。Yu等的研究表明，通常使用16S的V3区进行PCR扩增后进行DGGE分析，如果所测的序列长度比较长时，也可以使用16S的V3-V5或V6-V8区。DGGE指纹图谱分析：目前，DGGE电泳图谱的分析最常用的是相似性聚类分析法。DGGE胶通过扫描仪输入计算机，通过MolecularAnalysis软件进行相似性分析。通过DGGE后得到的指纹图谱，每一个条带代表某个微生物优势菌群，通过测序和序列比对，可以得出此优势菌群的种类。DGGE操作步骤1、将海绵垫固定在制胶架上，把类似“三明治”结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己。2、共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为15.5cm，短的那根长9cm。将短的那根与Y形管相连，两根长的则与小套管相连，并连在30ml的注射器上。3、在两个注射器上分别标记“高浓度”与“低浓度”，并安装上相关的配件，调整梯度传送系统的刻度到适当的位置。4、反时针方向旋转凸轮到起始位置。为设置理想的传送体积，旋松体积调整旋纽。将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置，旋紧体积调整旋纽。例如16×16cmgels(1mmthick)：设体积调整装置到14.5。5、配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中。6、每管加入18μlTEMED，80μl10%APS，迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。用连有聚乙烯管标有“高浓度”的注射器吸取所有高浓度的胶，对于低浓度的胶操作同上。7、通过推动注射器推动杆小心赶走气泡并轻柔地晃动注射器，推动溶液到聚丙烯管的末端。注意不要将胶液推出管外，因为这样会造成溶液的损失，导致最后凝胶体积不够。8、分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好，注意这里一定要把位置放正确，再将注射器的聚丙烯管同Y形管相连。9、轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液，在这个步骤中最关键的是要保持恒定匀速且缓慢地推动凸轮，以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝胶板中。10、小心插入梳子，让凝胶聚合大约一个小时。并把电泳控制装置打开，预热电泳缓冲液到60℃。11、迅速清洗用完的设备。12、聚合完毕后拔走梳子，将胶放入到电泳槽内，清洗点样孔，盖上温度控制装置使温度上升到60℃。13、用注射针点样（预先准备好的活性污泥16SrDNAV3区PCR扩增产物，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化）。14、电泳（200V，5h）。15、电泳完毕后，先拨开一块玻璃板，然后将胶放入盘中。用去离子水冲洗，使胶和玻璃板脱离。16、倒掉去离子水，加入250ml固定液（10%乙醇，0.5%冰醋酸）中，放置15min。17、倒掉固定液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入250ml银染液（0.2%AgNO3，用之前加入200μl甲醛）中，放置在摇床上摇荡，染色15min。18、倒掉银染液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入250ml显色液（1.5%NaOH，0.5%甲醛）显色。19、待条带出现后拍照。DGGE操作注意事项1、配置试剂时一定要用去离子水，制胶洗膜时用的各个容器也要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。2、制胶是实验的关键。在往玻璃板中灌胶时，要匀速地转动滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。3、灌完胶后，立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。4、DGGE的电泳缓冲液要超过“RUN”刻度线，不要超过“Maximam”刻度线。5、点样时，要用小型注射器，伸入点样孔底部点样。6、银染的整个过程中，一定要戴手套。以避免手接触胶而带来的污染。7、每次用完仪器后要及时清理，清洗玻璃板培养皿等玻璃仪器。实验中常见问题分析1、DGGE图谱的优化：利用DGGE分析复杂样品时，获得高分辨率的图谱是重要的前提条件。影响DGGE分辨率的因素很多。如DNA(或RNA)提取效果、PCR(或RT-PCR)扩增效果、电泳时间、电泳温度、凝胶浓度、变性剂梯度、染色方法等。在DGGE的操作过程的每一个环节都会对后续分析产生影响并导致误差的产生，因此为了获得DGGE的最大分辨率，必须对全部环节进行优化。2、DGGE图谱的分析：在获得DGGE图谱后，需要对图谱中条带的核酸序列进行分析，并对图谱进行统计学分析，阐述不同样品间的关系，从而合理的解释复杂的指纹图谱。随着DGGE的广泛应用，一些统计学方法也不断应用于图谱的分析。这些分析方法从不同角度对图谱进行归纳总结。如解释群落结构和演替规律，种群遗传多样性，优势条带的位置和强度分析等。无论选择哪种分析方法，对数据分析时得到的结论都应该是一致的。参考文献J.萨姆布鲁克，E.F.弗里克，T.曼妮阿蒂斯.1992.分子克隆实验指南，第二版.金冬雁等译.北京：科学技术出版社邢德峰，任南琪.2006.应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析[J].微生物学报46（2）：331-335宫曼丽，任南琪，邢德峰.2004.DGGE/TGGE技术及其在微生物分子生态学中的应用.微生物学报[J]，2004，44（6）：845-848MuyzerG，SmallaK.1998.Applicationofdenaturinggradientgelelectrophoresis（DGGE）andtemperaturegradientgelelectrophoresis（TGGE）inmicrobialecology[J].AntonievanLeeuwenhoek，1998，73：127-141KisandV，WiknerJ.2003.Limitedresolutionof16SrDNADGGEcausedbymeltingpropertiesandcloselyrelatedDNAsequences[J].JMicrobiolMethods，2003，54：183-191