哈工程分析化学第5章色谱分析法

第5章色谱分析法5.1色谱分析法基础5.2色谱基础理论5.3气相色谱法5.4高效液相色谱法5.5色谱定性与定量分析方法5.6超临界流体色谱法简介5.7高效毛细管电泳分析法简介本章教学基本要求1.熟悉色谱分析方法的特点、分类、作用；理解色谱的基本分离过程。2.掌握气相色谱仪的基本结构，检测器的作用和原理，检测器的性能，固定相极性。3.掌握影响气相色谱分离的各种因素及必要的操作条件选择。4.重点掌握塔板理论、速率理论、分离度及相关计算，色谱分析的各种定性定量方法。5.掌握毛细管色谱、液相色谱基本原理及应用对象。6.了解超临界流体色谱的特点及应用。5.1.1色谱法概述俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置：如图。色谱法是一种分离技术，试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过固定相的流体（气体或液体），称为流动相。5.1色谱分析法基础玻璃管—色谱柱CaCO3—固定相石油醚—流动相叶绿素的分离（动画）色谱法的分离原理当流动相中携带的混合物流经固定相时，并与固定相发生相互作用。利用不同组分在两相（固定相和流动相）中，具有不同的分配系数或吸附系数，当两相作相对运动时，这些物质在两相中反复多次的分配或吸附，这样就使得那些分配系数或吸附系数只有微小差异的组分产生很大的分离效果。使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础5.1.2色谱法特点与分类气相色谱流动相为气体（称为载气）。按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱填充柱3～6mm毛细管柱0.1～0.5mm填充柱色谱流程图（动画）毛细柱色谱流程图液相色谱液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂为固定相，不同pH值的水溶液为流动相。其他色谱方法薄层色谱和纸色谱：比较简单的色谱方法凝胶色谱法:超临界色谱:高效毛细管电泳:九十年代快速发展、特别适合生物试样分析分离的高效分析仪器。纸层析（动画）气相色谱法的特点（1）分离效率高：复杂混合物，有机同系物、异构体；手性异构体。（2）灵敏度高：可检出µg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。（3）分析速度快：一般在几分或几十分内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广：适用于沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。不足之处：不适用于高沸点、难挥发、热不稳定物质的分析。被分离组分的定性较为困难。5.1.3气相色谱基本原理与分离过程气相色谱基本原理与分离过程气相色谱分离过程是在色谱柱内完成的。填充柱色谱:气固和气液色谱，两者分离机理不同。气固色谱的固定相:多孔性的固体吸附剂颗粒。固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。气液色谱的固定相:由担体和固定液所组成。固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。气固色谱的分离机理:吸附与脱附的不断重复过程；气液色谱的分离机理：气液两相间的反复多次分配过程。气相色谱分离过程（动画）两相分配（动画）当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附。随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附，挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附。随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行。气相色谱分离过程分配系数K组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g·mL-1）比，称为分配系数，用K表示，即：smcKccs和cm分别表示组分在固定相和流动相中的浓度分配系数K的讨论一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。smcKc（动画）5.1.4色谱基本参数与色谱流出曲线的表征气相色谱的流出曲线1.基线无试样通过检测器,仅有载气通过检测器时，检测到的信号即为基线.基线漂移：指基线随时间定向的缓慢变化。基线噪声：指由各种因素所引起的基线起伏波动2.保留值（1）用时间表示的保留值保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间。死时间（tM）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间。调整保留时间（tR＇）：tR＇=tR－tM（2）用体积表示的保留值死体积（VM）：指不被固定相吸附或溶解气体（空气或甲烷）从进样开始到柱后出现浓度最大值时，所通过载气的体积。F0为色谱柱出口处的载气流量，单位：mL/min。VM=tM×F0死体积VM是由三部分组成:①是填充柱内固定相颗粒间所剩留的空间②是气相色谱仪管路连接处的空间③是检测器的死空间一般来说后两项的空间是很小的，可忽略不计。3.相对保留值r21相对保留值只与①柱温和固定相性质有关，与②其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。(2)(2)(2)(2)21(1)(1)(1)(1)''''RRRRRRRRtVtVrtVtV组分2与组分1调整保留值之比：保留体积（VR）：指被测组分从进样开始到柱后出现浓度最大值所通过的载气体积。VR=tR×F0调整保留体积（VR＇）：VR＇=VR－VM4.区域宽度用来衡量色谱峰宽度的参数。有三种表示方法：（1）标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度Y1/2=2.354（3）峰底宽(Wb或Y)：Wb=4Wb=1.699Y1/2色谱流出曲线可以解决以下三个问题：（1）根据色谱峰的位置（保留值）可以进行定性分析；（2）根据色谱峰的面积或峰高可以进行定量分析；（3）根据色谱峰的位置及其宽度，可以评价色谱柱分离效果。5.2色谱基础理论5.2.1色谱基本关系式1.分配比分配系数K：组分在两相间的浓度比；分配比k（partitionratio，也称容量因子）是指在一定温度下，在两相间达到分配平衡时，组分在两相中的质量比k：平衡时，组分在各相中总的质量比；k=MS/MmMS、Mm分别为组分在固定相和流动相中的质量。2.容量因子k与分配系数K的关系式中β为相比。填充柱相比：6～35；毛细管柱的相比：50～1500SSSSsSSmmmmmMVMVcVKkMMcVVVM//SSSMMMScMVVKkkcMVV3.分配比与保留时间的关系容量因子越大，保留时间越长。可由保留时间计算出容量因子：'RMRMMtttktt5.分配系数与分离温度的关系分离过程中的温度变化必然要影响到溶质在两相中的分配，即分配系数是物质的一种热力学参数。对于一定的溶质和固定相，溶质的分配系数与分离温度间存在以下关系：lgCaKbT式中，a，b为常数，TC为分离时的绝对温度。由此可见，分离温度越高，分配系数越小，即溶质在流动相中的浓度越大，保留时间越短，组分色谱峰流出分离柱也越快。在色谱理论的发展过程中，其中较重要的理论有塔板理论和速率理论。塔板理论反映了色谱分离过程的热力学行为，并提出了塔板数，塔板高度等概念，解释了保留值的大小，两峰间距离发生变化的现象。5.2.2塔板理论-柱分离效能指标而速率理论主要描述了色谱峰宽度，组分在色谱柱中的扩散和运行速度等问题，是色谱的动力学行为。因此塔板理论和速率理论是从两个方面描述一个较完整的分离行为。除了塔板理论和速率理论之外，还有非平衡理论和质量理论。本节只讨论塔板理论和速率理论。塔板理论最早于1941年，由马丁（Martin）和詹姆斯(James)提出，并用数学模型描述了色谱分离过程。它把整个色谱柱比拟作分馏塔，因而直接引用了处理分馏过程的概念，理论和方法来处理色谱过程，即将连续的色谱过程看作是许多小段平衡过程的重复。这个半经验理论把色谱柱比作一个分馏塔。色谱柱可由许多假设的塔板组成，在每块塔板内，一部分空间为涂在担体上的液相占据，另一部分空间被载气（气相）所占据，载气所占据的空间称为板体积ΔV。当欲分离的组分随载气进入色谱柱后，就在两相间进行分配。由于流动相在不停地移动，组分就在塔板间隔的气-液两相间不断地达到分配平衡。塔板理论假定：（1）在每块塔板上，组分在两相间的分配平衡是瞬间完成的。每次分配平衡所需要的一段柱长称为理论塔板高度，用H表示。（2）载气进入色谱柱，不是连续的，而是脉冲式的，每次进气为一个板体积ΔV。（3）试样开始时都加在第0号塔板上，而且试样沿色谱柱方向的扩散（纵向扩散）可忽略不计。（4）在所有的塔板上，组分在两相中的分配系数K（或分配比k）是常数色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：理论塔板数与色谱参数之间的关系为：222116545)()(./bRRWtYtnLHn色谱峰越窄，理论塔板数n越多，理论塔板高度H就越小，此时柱效能越高，因此n和H可作为评价柱效能的一个指标。由于死时间tM(或死体积VM)的存在，它包括在tR（或VR）中，而tM(或VM)不参加柱内的分配，因此尽管计算出来的n很大，H很小，但色谱柱表现出来的实际分离效能却并不好，特别是对流出色谱较早（tR较小）的组分更为突出。需引入有效塔板数和有效塔板高度：有效塔板数和有效塔板高度222116545)()(./bRRWtYtn有效有效有效nLHWtYtnbRR2'22/1')(16)(54.5有效塔板数n有效和有效塔板高度H有效是扣除可死时间（或死体积）的影响.因此更能真实地反映柱效能的好坏塔板理论的特点和不足：(1)当色谱柱长度一定时，塔板数n越大(塔板高度H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数及理论塔板数不同，用塔板数和塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。总结：塔板理论能解释①色谱流出曲线的形态（呈正态分布）;②浓度极大点的位置（t=tR）；③计算评价柱效能等方面都取得了成功.塔板理论不能解释①塔板高度是受哪些因素影响的这个本质问题；②也不能解释为什么在不同流速（F）下可以测得不同的理论塔板数这一实验事实：22()022Rttccec0为进样浓度，tR为保留时间，σ为标准偏差，c为时间t时柱子出口的浓度图载气流速对塔板数的影响速率理论——VanDeemter方程式1956年荷兰学者范弟姆特（VanDeemter）等提出了色谱过程的动力学理论，他们吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合进去，导出了塔板高度H与载气线速度u的关系：5.2.3速率理论-影响柱效的因素BHACuuH：理论塔板高度，u：载气的线速度(cm/s)载气的线速度是指单位时间内载气流过色谱中的距离，一般以cm/s表示减小A、B、C三项可提高柱效；A、B、C三项各与哪些因素有关？1.涡流扩散项－AA=2λdpdp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。A与载气流速u无关。涡流扩散（动画）2.分子扩散项--B2mBDγ：弯曲因子，填充柱色谱，γ1。Dm：试样组分分子在流动相中的扩散系数（cm2·s-1）。由于柱中存在着浓度差，产生纵向扩散：a.扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差。b.分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑c.扩散系数