透射电镜样品制作(2015-12-11)

１透射电镜样品包埋块制作原理步骤一、取材：1、动作迅速：组织离体后，应将其快速放入4℃戊二醇固定液中，使组织细胞尽可能保持原来的生活状态。2、减少损伤：选择锋利切割器械，减少牵拉或挤压组织。3、组织块大小：取材医生可先切成长条形，然后再修成约1mm3大小。二、固定：固定目的是把细胞在活体状态时的超微结构细节尽可能完整地保存下来，避免自身酶的分解而出现自溶，或因外界微生物的入侵繁殖而产生腐败，致使细胞的超微结构遭受破坏。同时也使细胞内的各种成分固定下来，避免以后的冲洗和脱水时溶解和流失。理想的固定剂应具备以下特点：能够迅速又均匀地渗透到组织结构内；能够稳定细胞各种结构成分，使之在以后处理过程中不致溶解和丢失；对细胞超微结构没有损伤；能供细胞化学测定并能增强图像反差。当然，满足所有要求的固定剂是不存在的，目前常用固定剂有锇酸和戊二醇。1.使用锇酸的注意事项：锇酸即四氧化锇，它能和细胞内绝大多部分成分反应，且能够保护脂肪，但对碳水化合物、糖类和核酸保护作用差，锇酸渗透差，分子密度大，经锇酸固定的组织在电镜下能获得较好反差。锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，对呼吸道有强烈刺激作用，必须在通风橱中操作，废液必须收集在密闭容器中。常用的锇酸溶液为2%的储备液，使用之前需用0.2MPBS稀释成1%的锇酸溶液。2.戊二醇戊二醇能够稳定糖原，同时保存某些锇酸保护作用差的蛋白质结构，对酶活性破坏小。对微管、滑面内质网等固定较好，对脂肪保护差，且反差小，因此必须和锇酸配合使用，即“双重固定法”。3.固定方法：样本先用2.5%戊二醇在4℃下固定2h，经PBS缓冲液多次清洗后再用1%锇酸固定2h。根据不同组织，可适当延长固定时间。由于戊二醇能够和锇酸反应产生电子致密的还原锇沉淀，组织经戊二醇固定后，必须将戊二醇清洗干净才能转入锇酸。此外，锇酸又能和乙醇作用生成沉淀，因此锇酸固定后也应用PBS清洗液进行清洗干净方能进行脱水处理。一般清洗3次，每次15min左右(或过夜)。三、脱水：脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。由于常用的包埋剂，如环氧树脂，大多都是非水溶性树脂，只有将生物组织中的游离水清除干净，包埋剂才能浸入组织，常用脱水剂是乙醇和丙酮。乙醇对细胞物质抽提少，组织收缩也少，但它和环氧树脂互溶性差，因此使用乙醇脱水时须用环氧丙烷作为中间溶剂。丙酮和酒精、环氧丙烷互溶，所以通常先用乙醇后再用丙酮的脱水方法。急剧脱水会引起细胞收缩，因此应采用逐级脱水(50%-70%-90%-100%乙醇)而不能急剧脱水。更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡；脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70%乙醇或丙酮中，并在4℃保存。四、包埋1.渗透：渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外空隙被包埋剂所填充。一般可先用环氧丙烷对半稀释的包埋剂浸透1-2h，再用纯包埋剂37℃烤箱渗透2h左右。包埋剂通常由树脂、硬化剂、增塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制而成。2.包埋：目的是以包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬固体。理想包埋剂应具备的条件：黏稠适中，有良好切割性；能经受电子轰击；透明度较好；对人体无害。目前常用国产环氧树脂618、Epon812环氧树脂、及低黏度包埋剂Spurr。3.环氧树脂：环氧树脂为热塑性树脂，主要有两种化学反应基团，即环氧基和羟基。末端环氧基易与其他含活性氢原子化合物如胺类反应，形成首尾相接的长链状聚合物。单体中羟基能与酸酐结合，形成分子间横桥连接。因此，把环氧树脂单体、胺类、酸酐等三者按一定比例混合，加上适当温度，可形成稳定的交２链状聚合物。包埋剂配制及使用过程中的注意事项：1.所有容器及玻璃棒等应是清洁和干燥的；2.配制过程中应搅拌均匀，使用过程中应避免异物，特别是水、乙醇、丙酮等混入包埋剂；3.配制好的包埋剂应密封保存，避免受潮。剩余包埋剂可密封并储存在-10—-20℃冰箱中，延长其使用期。4.常用树脂制方国产树脂618：618树脂5ml十二碳烯基丁二酸酐DDSA(固化剂)5ml笨二甲酸二丁酯DBP（增塑剂）0.3ml2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚DMP-30（加速剂）0.1mlEpon812环氧树脂：A液B液Epon81262mlEpon812100mlDDSA(固化剂)100mlMNA(甲基内次甲基四氢邻笨二甲酸酐，固化剂)89mlA液和B液比例：冬季2:8，夏季1:9，B液可增加包埋块硬度低黏度包埋剂Spurr：ERL-4206(_vinylcyclohexenedioxide)单体10gNSA(nonenylsuccinicanhydride)硬化剂26gDER-736resin增塑剂(可调整硬度)6gDMAE(dimethyl-aminoethanol)加速剂0.4g5.包埋方法Spurr70℃烤箱内8h即可固化，60℃时间要相应延长，减少DER-736量可增加硬度。国产树脂618、Epon812环氧树脂需37℃过夜，经45℃12h、60℃24h可固化，干燥存放。五、切片1.修快首先粗修把多余树脂磨掉，然后在双筒镜下把端面修平，使组织面暴露，然后再修成45℃四面锥体。顶端面可修成长方形或梯形，注意上下面平行。半薄切片顶端面积以1-2mm2左右为宜，修成直角梯形便于定位。2.切片操作固定好组织块，调整刀的高低、角度和刀刃位置，调整刀槽内的液面，调整组织块与刀的距离，选择切片速度及厚度。可根据干涉色判断切片厚度：灰色40-50nm；银白色50-70nm；金黄色70-90nm；紫色90nm以上。灰色、银色较薄，但反差小，金色分辨率低，反差好，紫色太厚，一般不能观察。六、染色1.醋酸铀：是目前应用最广泛染色剂，能和大多数成分相结合，对核酸、核蛋白、结缔组织纤维、糖原、分泌颗粒、溶酶体均可染色，但对膜结构染色效果较差。醋酸铀在水和乙醇中溶解度较差，一般用50%或70%乙醇或丙酮配制成2%-3%的溶液。组织块染色1-2h，切片染色30min即可。长时间染色可引起糖原抽提和组织变形。2.枸橼酸铅：铅染色其应用也很普遍，它具有很高的电子密度，对细胞超微结构均有广泛亲和力，能提高细胞膜系统及脂类反差。铅染液易与空气中二氧化碳接触形成碳酸铅沉淀，污染切片。一般染10-20min即可，长时间染色可使反差全部增强，不利于观察。３枸橼酸铅染液配制：硝酸铅1.33g枸橼酸钠1.76g双蒸水30ml混合后振荡30min呈乳白色，加入新配1mol/LNaOH8ml,然后加双蒸水至50ml，调PH至12附表表1戊二醛溶液的配制终浓度1.01.52.02.53.04.05.00.2MPBS/ml5050505050505025%戊二醛水溶液/ml46810121620重蒸水加至/ml100100100100100100100表20.2M磷酸缓冲液（PBS）的配制按下表比例混合A、B液后，配成0.2mol/L的母液，其中pH7.0为常用配方pH值5.86.06.26.46.66.87.07.27.47.67.88.0A液8.012.318.526.537.549.061.072.081.087.091.594.7B液92.087.781.673.562.551.039.028.019.013.08.505.30在缓冲液中加入葡萄糖，蔗糖或氯化钠等均能改变渗透压。表3多聚甲醛-戊二醛固定液的配制溶液名称剂量10%多聚甲醛溶液20ml0.2MPBS或二砷酸盐缓冲液50ml25%戊二醛水溶液10ml重蒸水20mlA液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液B液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液Na2HPO428.4g或Na2HPO4.H2O31.61g或Na2HPO4.2H2O35.6g或Na2HPO4.7H2O53.63g或Na2HPO4.12H2O71.64g加双蒸水至1000mLNaH2PO424.0g或NaH2PO4.H2O27.6g或NaH2PO4.2H2O31.21g加双蒸水至1000mL４透射电镜样本制备1.登记好需要制备样本数量及相应位置顺序。2.摆放好脱水盒，加入适量PBS,依次按顺序转移组织块至脱水盒内。3.先穿一个空盒作为上盖，再依次把脱水盒穿起来，放入脱水瓶内，加入10mlPBS,4℃存放，过夜，每天换液一次，换液两次。4.配制脱水剂：PBS、1%锇酸（PBS对半稀释）、双蒸水、50%酒精、70%酒精、90%酒精、100%酒精、50%丙酮、70%丙酮、90%丙酮、100%丙酮（4℃）、100%丙酮（常温）、50%环氧丙烷，共13个，其中第一个PBS直接用原瓶即可。5.脱水程序：锇酸1.5h，水1min，其它每步6min。6.把组织块放入预先环氧丙烷稀释好的包埋树脂中浸透1h。7.取出脱水盒，先旋转几下，防止组织块贴壁（注意动作要快，如果组织块较多，中间应多次湿润组织快）。8.把组织依次块放入包埋模具中，过夜浸透。9.牙签轻轻调整组织块位置，尽量贴边。10.聚合器中加热聚合：37℃12h、48℃24h、60℃48h。