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医学信息检索综述150611035620993390335342479126150612031709815492859238795109陈杰昌2012111393临床医学(肿瘤)摘要:大量研究表明,在结肠癌较早阶段,临床影像学未发现转移证据之前,就开始发生细胞水平的微转移,即使病人行手术和化疗后,仍会发生肿瘤复发,甚至远处转移。一个重要的原因是结肠癌细胞对化疗药物产生了多药耐药(Multi-drugResistance,MDR)。MDR是肿瘤细胞对化疗耐药的主要形式,它是指一种药物作用于肿瘤细胞使之产生耐药性后,该肿瘤细胞逐渐对未接触过的、结构无关、作用靶点和机制不同的多种抗肿瘤药物也具有交叉耐药性,这是长期以来结肠癌治疗效果不佳的重要原因之一。有关资料统计,肿瘤年死亡率中,与原发性多药耐药(intrinsicMDR)有关的肿瘤约占肿瘤年死亡率的61%,与获得性多药耐药(acquiredMDR)有关的肿瘤约占33%,由此可见肿瘤的MDR现象广泛存在,是导致化疗失败、影响患者生存率的主要因素。因而从该意义上讲,MDR几乎是所有恶性肿瘤所面临的共同问题。关键词:结肠癌、热疗、MDRAbstract:Alargenumberofstudiesshowthatincoloncanceratanearlystage,clinicalimagingdidnotfindevidenceofmetastasesbefore,begantohorizontalcellsmicrometastasis,eveninpatientsaftersurgeryandchemotherapy,tumorrecurrenceordistantmetastasis.Oneimportantreasonisthatcoloncancercellshaveamultidrugresistance(ResistanceMulti-drug,MDR)tochemotherapydrugs..MDRisthemainformsoftumorcellresistancetochemotherapy,itisreferstoakindofdrugintumorcellsofresistance,thetumorcellsgraduallytodidnotcomeintocontactwiththestructure,independent,targetandmechanismofdifferentkindsofantitumordrugsalsohascrossresistance,itislong-termsincethenodethemostimportantcauseofcancertherapyisineffectiveone.Relevantstatistics,intumormortality,andprimarymultidrugresistance(intrinsicMDR)ofcanceraccountsforaboutmortalityrateof61%intumor,andobtainedmultidrugresistance(acquiredMDR)ofcanceraccountsforabout33%,thustumorMDRphenomenonwidelyexistsisleadtothefailureofchemotherapy,themainfactorsaffectingthesurvivalrateofthepatients.Thus,inthissense,MDRisalmostthecommonproblemforallcancers..Keywords:Coloncancer,hyperthermia,MDR大量研究表明,在结肠癌较早阶段,临床影像学未发现转移证据之前,就开始发生细胞水平的微转移,即使病人行手术和化疗后,仍会发生肿瘤复发,甚至远处转移。一个重要的原因是结肠癌细胞对化疗药物产生了多药耐药(Multi-drugResistance,MDR)。MDR是肿瘤细胞对化疗耐药的主要形式,它是指一种药物作用于肿瘤细胞使之产生耐药性后,该肿瘤细胞逐渐对未接触过的、结构无关、作用靶点和机制不同的多种抗肿瘤药物也具有交叉耐药性,这是长期以来结肠癌治疗效果不佳的重要原因之一。有关资料统计,肿瘤年死亡率中,与原发性多药耐药(intrinsicMDR)有关的肿瘤约占肿瘤年死亡率的61%,与获得性多药耐药(acquiredMDR)有关的肿瘤约占33%,由此可见肿瘤的MDR现象广泛存在,是导致化疗失败、影响患者生存率的主要因素。因而从该意义上讲,MDR几乎是所有恶性肿瘤所面临的共同问题。因此,研究MDR发生的起因,阐明调节MDR事件的分子机制,探索切实有效的能够逆转或者消除肿瘤MDR的方法,无论是对结肠癌的防治,还是对我国MDR研究先进性的提升,均具有重要而现实的意义。本次研究主要内容:(1)自噬在热疗介导的结肠癌细胞Lovo/L-OHP逆转MDR中的作用:分别通过使用自噬抑制剂3-MA或应用Beclin-1siRNA表达阻断自噬形成,使用Beclin-1PCDNA3.1激活自噬,观察自噬对热疗逆转结肠癌细胞Lovo/L-OHPMDR的影响。(2)自噬在热疗抑制Lovo/L-OHP裸鼠移植瘤生长和逆转MDR中的作用:将稳定表达的耐药株Lovo/L-OHP和敏感株Lovo的结肠癌细胞分别于裸鼠皮下注射,成瘤后按研究方案的方法进行热疗,通过使用Beclin-1SiRNA阻断自噬形成或使用Beclin-1PCDNA3.1激活自噬,观察自噬对结肠癌裸鼠皮下移植瘤MDR生物学特性的影响。(3)热疗对结肠癌Lovo/L-OHP细胞自噬启动和逆转MDR的作用:观察热疗作用于体外培养的人结肠癌Lovo/L-OHP细胞株后自噬相关蛋白的表达、自噬体及自噬溶酶体的形成,探讨热疗与自噬启动的关系。观察热疗作用下耐药株耐药指数的变化、MDR相关基因和蛋白的变化(MDR1/p-gp),探讨热疗逆转MDR的机制。(4)热疗抑制结肠癌Lovo/L-OHP细胞自噬启动的信号通路:分别使用信号通路抑制剂LY294002或通路激活剂IGF-1作用于PI3K/Akt/mTOR后,检测热疗调控自噬的关键信号传导通路分子Akt及mTOR的改变,探讨PI3K/Akt/mTOR通路在热疗抑制Lovo/L-OHP细胞自噬启动中的作用。(5)临床实验部分:在体外和动物模型实验有效性的基础上,进一步进行临床实验。收集高精度热疗前后临床病理资料和血清标本并检测PI3K/Akt/mTOR通路、自噬、MDR关键分子的表达,分析比较动物实验及人体标本中的表达差异。思路和方法:1)建立稳定的耐药细胞株:采用逐步增加奥沙利铂药物浓度的方法,产生结肠癌奥沙利铂耐药细胞株。利用MTT法先后测定敏感细胞株和耐药细胞株的IC50,待耐药细胞株的IC50为敏感细胞株的10倍以上时,命名为Lovo/L-OHP。2)自噬抑制剂3-MA或siRNA-Beclin-1阻断自噬和使用PCDNA3.1-Beclin-1激活自噬对热疗抑制结肠癌耐药株Lovo/L-OHP侵袭力和MDR的影响:不同温度热疗(37、39、41、43、45℃)分别作用于结肠癌耐药株Lovo/L-OHP,以敏感株Lovo为对照,每一热疗温度于3个时间点(0.5h、1h、2h)收集细胞,双向调节自噬,观察结肠癌耐药株Lovo/L-OHP自噬水平的变化以及对细胞活力、细胞凋亡、侵袭和MDR的影响,并进行统计学分析。具体指标和检测方法如下:①细胞活力:MTT法、克隆形成实验。②细胞凋亡:a).凋亡细胞计数:AnnexinⅤ+PI双染,流式细胞仪检测细胞凋亡;b).caspase3活性检测:荧光酶联免疫吸附法(FINEA法);c).凋亡小体形成:原位缺口末端标记法(TUNEL)检测。③侵袭力:细胞划痕实验、Transwell小室侵袭实验。④自噬:a).Western-blot检测自噬相关蛋白(beclin-1)、自噬体蛋白(LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)表达变化;b).流式细胞仪检测MDC染色荧光强度;c).电镜观察自噬体、自噬溶酶体的形成及数量。⑤MDR的检测:a).MTT法检测IC50值和奥沙利铂的耐药指数;b).Rhol23外排试验检测对p-gp外排的影响;c).RT-PCR检测MDR1的变化;d).Western-Blot检测MDR相关蛋白p-gp。2)体内实验:将培养的人结肠癌Lovo/L-OHP多药耐药细胞株以0.5%胰蛋白酶溶液消化,收获贴壁生长的癌细胞,制备成癌细胞悬液备用。1)人结肠癌SD大鼠动物模型的制备实验动物的选择:SD大鼠160只,雌雄不限,体重230g~250g,实验动物单独饲养,自由进食与饮水,实验操作注意无菌观念。人结肠癌Lovo/L-OHP多药耐药SD大鼠动物模型制作:人结肠癌Lovo/L-OHP多药耐药细胞株储存于-273℃液氮中,应用时快速冻融,迅速移至37℃的温水中快速融解,转移至含10%胎牛血清及青、链霉素的DMEM培养基中,在37℃、5%CO2的恒温箱中进行培养。每2d换液,4d传一代,实验所使用的细胞传代次数在10代以内。免疫抑制处理:按200mg/kg体重于动物腹部皮下注射阿糖胞苷,48h后,将实验动物按10Gy的吸收剂量进行60Co全身照射,照射后的大鼠饲养于洁净的动物房,保持室温在20℃左右。结肠癌耐药株Lovo/L-OHP于SD大鼠腹股沟处皮下注射,注射的细胞数均为1×106个;接种后,隔日观察肿瘤的生长情况,并记录平均直径。主要实验仪器:恒温水浴箱、热敷袋等。2)动物分组及干预:制备完好的人结肠癌SD大鼠动物模型160只,随机分为8组,每组20只。将稳定表达的耐药株Lovo/L-OHP和敏感株Lovo的结肠癌细胞分别于裸鼠皮下注射,SD大鼠荷瘤14天,肿瘤体积长至7mm×7mm左右大小后开始进行热疗1h,通过使用3-MA或siRNA-Beclin-1瘤内注射阻断自噬形成或PCDNA3.1-Beclin-1激活自噬。3周后处死各组大鼠,处死前测体重,摘取大鼠肺组织及皮下移植瘤,部分组织置液氮保存,用于石蜡和冰冻切片以及电镜观测。本次研究结果展示:结果分析:本实验取得了准确且具有临床意义的实验数据,该数据能为第三部分的临床实验提供依据。建立稳定的耐药细胞株:采用逐步增加奥沙利铂药物浓度的方法,产生结肠癌奥沙利铂耐药细胞株。利用MTT法先后测定敏感细胞株和耐药细胞株的IC50,待耐药细胞株的IC50为敏感细胞株的10倍以上时,命名为Lovo/L-OHP。本实验需要大量的Lovo细胞和Lovo/L-OHP细胞,做加热或加药处理后,细胞生长的很慢,需要很长时间才能达到实验所需。解决办法为继续大量培养细胞。对研究工作的进一步设想:进行第二部分实验研究,明确热疗对结肠癌细胞自噬启动和逆转MDR的影响及其关键信号通路的变化;在前两部分的实验基础上,进行第三部分临床实验研究,探讨热疗、自噬、MDR的关系,从临床角度印证前两部分实验结果,分析差异。参考文献:1、LiangH,LiJW,ShiYR,etal.ChangeinE.cadherin,al.pha.beta.andgamma.cateninexpressionafterhyper.thermiaofahumancoloncarcinomacelllineinvitro.ChineseMedicalJournal.20042、DeHaas-KockDF,BuijsenJ,Pijls-JohannesmaM,etal.Concomitanthyperthermiaandradiationtherapyfortreatinglocallyadvancedrectalcancer.CochraneDatabaseofSystematicReviews.20093、刘文超.开展热疗,推动肿瘤治疗的进步[J].临床肿瘤学杂志.2011(06)4.、杨农,etal.,XR
本文标题:医学信息检索综述---陈杰昌
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