医学分子生物学实验技术

1、基因：是遗传的物质基础，是DNA或者RNA分子中携带遗传信息的特定核苷酸序列。2、基因组：是指单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部DNA或RNA分子，每个生物的基因组携带者构成和维持该生物体生物形式所必需的所有生物信息。3、逆转录：以RNA为模板，由反转录酶催化四种dNTP聚合，产生DNA的过程。4、聚合酶链反应：是一种由引物介导利用DNA聚合酶在体外扩增目的基因的方法，也叫基因扩增技术。5、限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。6引物：是一种与DNA模板链互补的线性核苷酸变短，其3’末端为游离的-OH，细胞内复制所需的引物是一小段RNA。催化游离dNTP之间相互聚合。7、TaqDNA聚合酶：从一种嗜热菌株中分离得到的耐热的DNA聚合酶。8、退火:热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程成为退火。9、启动子：是位于转录起始点附近，且为转录所必需的序列元件。10、DNA变性：当DNA收到某些理化因素作用时，DNA双链互补碱基对之间的氢键和相邻碱基之间的堆积力受到破坏，DNA分子被解开成单链，逐步形成为无规则线团的构象，不涉及核苷酸间共价键的断裂。1、RT-PCR的基本原理将RNA反转录与PCR过程结合的一种PCR技术，在反转录酶的作用下，以mRNA为模板，反转录生成DNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。2、DNA电泳的基本原理，按照支持物不同可以分为几类基本原理：核酸是两性电解质，在中性或偏碱性的pH溶液中均带负电，在电场中向正极泳动，不同的核酸在相对分子质量、分子形状等方面各有不同，在凝胶的空隙中泳动时电泳迁移率各不相同，因此借助电泳即可使其得到分离。分类：1琼脂糖凝胶电泳AGE2聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE3毛细管电泳3、总RNA提取后，如何鉴定RNA的纯度（1）紫外分光光度法：先通过A260与A280的比值判断核算的纯度，纯RNA的A260与A280的比值等于2.0，比值升高或降低均表示样品不纯。(2)琼脂糖凝胶电泳法：基因组DNA的分子量远远大于RNA，两者之间电泳迁移率存在很大差别，用荧光染料EB为示踪剂的AGE即可观察到RNA分子中是否含有DNA，细胞RNA的琼脂糖凝胶电泳一般可见三条条带，条带模糊比例不合适及弥散明显说明RNA有严重降解。4、PCR的基本原理和基本步骤，知道几种PCR（1）基本原理是以待扩增的DNA分子为模板，以一对人工合成的、分别与模板的5’端和3’端互补的单链寡核苷酸作为引物，在耐热DNA聚合酶催化下，按照半保留复制的原则合成两个子代DNA；接着以子代DNA为模板再次合成，如此反复循环十数次，最终将原始模板放大数百万倍。（2）PCR的基本步骤1.反应体系：包括模板DNA，耐热DNA聚合酶，两种引物，4种dNTP和含有镁离子的缓冲液。2.反应过程变性:将反应体系加热加热到94~95度，持续30秒左右，使待扩增DNA完全解链成单链。退火：使温度迅速下降到适宜温度并维持30秒，使引物与模板DNA两条链的3’端互补配对。退火温度由引物Tm决定，一般比引物的Tm低5度，其范围常在55~68度。延伸：将反应体系温度升高到72度，此时DNA聚合酶将以单链DNA为模板，将单核甘酸逐个添加到引物的3’端，使新链不断延长，直至合成结束。（3）PCR种类：反转录PCR，定量RT-PCR，实时荧光定量PCR，多重PCR,巢式PCR,反向PCR,原位PCR5、基因组DNA提取的原理（主要应用的试剂和作用）SDS蛋白酶法：主要用于提取动物组织细胞的基因组DNA。（1）首先利用含有SDS、蛋白酶K等成分的DNA抽提缓冲液作用于组织匀浆液，以充分裂解细胞，破坏染色体结构，并使组蛋白及其他胞内蛋白质变性、降解，释放出游离的DNA；（2）用酚/氯仿、氯仿/异戊醇等有机溶剂依此抽提，除去水相中的蛋白质、酚等杂质；（3）最后以乙醇或异丙醇沉淀水相即可得到较纯的基因组DNA。抽提缓冲液中的RNA酶可降解胞内RNA，乙二胺四乙酸（EDTA）则能有效抑制DNA酶的活性，防止DNA的降解。CTAB法与SDS蛋白酶法提取DNA的过程相似。6、RT-PCR反应体系中包括哪些试剂？他们的作用如何？1.RNA提取试剂：迅速破碎细胞并抑制细胞内RNase的同时，使核蛋白复合物变性，释放RNA。2.反转录酶：以mRNA为模板合成cDNA。3.第一链cDNA合成试剂盒：合成cDNA。4.RT-PCR引物：催化游离dNTP之间相互聚合。5.dNTP：为扩增DNA的原料。6.TaqDNA聚合酶：在高热条件下，催化聚合反应。