医学检验免疫学

第一节杂交瘤技术的基本原理第二节单克隆抗体的制备第三节基因工程抗体制备第四节单克隆抗体的应用将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，称为单克隆抗体。第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的原理是使免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，成为杂交瘤细胞，最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。将这种杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。一、杂交瘤技术包括两种亲本细胞的选择与制备，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选与克隆化（一）小鼠骨髓瘤细胞细胞株稳定，易于传代培养细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子该细胞是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株（二）免疫脾细胞免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，免疫途径多用腹腔内或皮内多点注射法如为珍贵微量抗原，可用脾脏内直接注射法进行免疫（三）细胞融合PEG（聚乙二醇）可能导致细胞膜上脂类物质的物理结构重排，使细胞膜容易打开而有助于细胞融合（四）杂交瘤细胞的选择性培养HAT培养液，是在基础细胞培养液内添加次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷1.脾细胞（指B细胞）在一般培养基中不能生长繁殖2.骨髓瘤细胞因缺乏HGPRT而合成DNA，骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能增殖而死亡3.杂交瘤细胞由骨髓瘤细胞和脾细胞融合形成的杂交瘤细胞由于与脾细胞融合，可获得其HGPRT，可以合成DNA。因此，杂交瘤细胞在选择性培养得以生存而被筛选出来二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养单个细胞培养又称克隆化细胞克隆化有以下几种方法：1.有限稀释法2.显微操作法3.荧光激活细胞分选仪4.软琼脂平板法三、阳性杂交瘤细胞的冻存目前均采用液氮保存细胞第二节单克隆抗体的制备一、单克隆抗体的两大产生方法（一）动物体内诱生法先在小鼠腹腔注射液体石蜡或弗氏不完全佐剂，一周后将杂交瘤细胞悬液注射腹腔，1～2周后，无菌抽取腹水，离心取上清液即可。（二）体外培养法将杂交瘤细胞置培养瓶中培养，待培养液颜色改变或细胞过多开始死亡时，收集上清液，离心去掉碎片及细胞即可。二、单克隆抗体的纯化从培养液或腹腔积液获得的单克隆抗体，不需要纯化即可应用于日常诊断或定性研究。由于其中含有大量来自培养基、宿主或克隆细胞本身的一些无关蛋白，如果用于免疫标记测定，如放射性核素、酶、荧光素或生物素标记等，必须进一步分离和纯化。三、单克隆抗体的性质鉴定（一）Ig类型测定（三）抗体效价测定（二）特异性测定（四）表位测定（五）亲和力测定（六）染色体分析四、单克隆抗体的特性（一）单克隆抗体的特性1.高度特异性2.高度的均一性和可重复性3.弱凝集反应和不呈现沉淀反应4.对环境敏感性（二）单克隆抗体的优点1.杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体2.可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体3.由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等4.由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗（三）单克隆抗体的局限性1.由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成2.单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体3.制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高第三节基因工程抗体的制备一、基因工程抗体的概念应用DNA重组及蛋白工程技术对编码抗体基因按不同需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体，称为基因工程抗体二、基因工程抗体的优点1.通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应2.基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位3.根据治疗的需要，制备新型抗体4.可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达形式，大量表达抗体分子，大大降低了生产成本三、人源化抗体制备人源化抗体的主要目的是减少抗体的异源性（一）嵌合抗体从杂交瘤细胞中分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区的基因连接，插入适当质粒，构建鼠-人嵌合的重链和轻链基因质粒载体，共同转染宿主细胞（如骨髓瘤细胞），表达鼠-人嵌合抗体（二）改形抗体利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补决定簇（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列，重构成既具有鼠源性单抗的特异性，又保持抗体亲和力的人源化抗体四、小分子抗体小分子抗体包括抗原结合片段（Fv）、单链可变区片段（ScFv）和单区抗体（SdAb）分子量小，可在大肠杆菌等原核细胞表达，在人体内穿透力强，有利于疾病的治疗五、抗体融合蛋白抗体融合蛋白是利用基因工程技术将抗体片段与其他生物活性蛋白融合所得的产物抗体融合蛋白具有多种生物学功能，并且表达的重组蛋白既不影响单链抗体的抗原结合能力，也不影响与之融合的蛋白质的生物学特性六、双特异性抗体双特异性抗体（BsAb）又称双功能抗体（BFA），它的两个抗原结合位点具有不同的特异性，应用于结合两种不同的抗原分子，在生物医学中有着重要的意义（一）化学交联BsAb（二）细胞工程BsAb（三）基因工程BsAb七、噬菌体抗体库技术是将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性。第四节单克隆抗体的应用一、检验医学诊断试剂（一）病原微生物抗原、抗体的检测（二）肿瘤抗原的检测（三）免疫细胞及其亚群的检测（四）激素测定（五）细胞因子的测定二、蛋白质的提纯单克隆抗体是亲和层析中重要的配体，将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如Separose2B，4B，6B等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原三、小分子抗体的应用1、肿瘤导向治疗2、放射免疫显像，协助肿瘤的诊断四、抗体融合蛋白的应用肿瘤的体内显像诊断病毒的诊断和抗病毒感染血液性疾病的诊断五、双特异抗体的应用在体外免疫检测中的应用在体内肿瘤放射免疫显像诊断中的应用在体内免疫治疗中的应用六、抗体库技术的应用和前景在肿瘤体外诊断中的应用在肿瘤诊断中的应用在肿瘤治疗中的应用