第五章分子发光分析

1第四章分子发光分析分子发光包括荧光、磷光、化学发光、生物发光和散射光谱等。2分子发光分析法教学要求掌握分子荧光、磷光的产生机理；掌握激发光谱和发射光谱特征。掌握荧光与分子结构的关系以及溶液的荧光强度影响因素。了解荧光分析法的特点及定量测定方法。了解荧光分析仪器的结构。3一、基本原理（一）荧光和磷光的产生处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。这种跃迁是符合光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。45单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s，而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4~1s以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态。辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫（VR）、内部转移（IR）、系间窜跃（IX）及外部转移（EC）等，6各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。下面结合荧光和磷光的产生过程，进一步说明各种能量传递方式在其中所起的作用。设处于基态单重态中的电子吸收波长为λ1和λ2的辐射光之后，分别激发至第二单重态S2及第一单重态S1。振动弛豫它是指在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出。发生振动弛豫的时间为10-12s数量级。78荧光、磷光能级图→振动弛豫S0S1S2T1吸光1吸光2振动弛豫在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出。9内转移当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。右图中指出，处于高激发单重态的电子，通过内转移及振动弛豫，均跃回到第一激发单重态的最低振动能级。荧光、磷光能级图S0S1S2T1吸光1吸光2内转移10荧光发射处于第一激发单重态中的电子跃回至基态各振动能级时，将得到最大波长为λ3的荧光。注意：基态中也有振动驰豫跃迁。很明显，λ3的波长较激发波长λ1或λ2都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长λ3为的荧光。荧光的产生在10-7-10-9s内完成。荧光、磷光能级图S0S1S2T1吸光1吸光2荧光3荧光11系间窜跃指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1→T1就是一种系间窜跃。通常，发生系间窜跃时，电子由S1的较低振动能级转移至T1的较高振动能级处。有时，通过热激发，有可能发生T1→S1，然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧光的机理。荧光、磷光能级图S0S1S2T1吸光1吸光2荧光3系间窜跃12磷光发射电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几率很小，因为这是禁阻跃迁。但是，由第一激发单重态的最低振动能级，有可能以系间窜跃方式转至第一激发三重态，再经过振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射磷光，这个跃迁过程（T1→S0）也是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为10-4-10s。因此，这种跃迁所发射的光，在光照停止后，仍可持续一段时间。荧光、磷光能级图S0S1S2T1吸光1吸光2荧光3磷光磷光13外转移指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。荧光与磷光的根本区别：荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的；而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。14S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量213外转换2T2内转换振动弛豫15（二）激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线荧光和磷光均为光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，可根据它们的激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制激发光谱曲线。应该指出，激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同，但激发光谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则是吸光度与波长的关系曲线，两者在性质上是不同的。当然，在激发光谱曲线的最大波长处，处于激发态的分子数16目是最多的，这可说明所吸收的光能量也是最多的，自然能产生最强的荧光。如果固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同的波长时所发射的荧光或磷光强度，即可绘制荧光或磷光光谱曲线。在荧光和磷光的产生过程中，由于存在各种形式的无辐射跃迁，损失能量，所以它们的最大发射波长都向长波方向移动，以磷光波长的移动最多，而且它的强度也相对较弱。荧光发射光谱的普遍特性：17（1）Stokes位移在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。（2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关因为分子吸收了不同能量的光子可以由基态激发到几个不同的电子激发态，而具有几个吸收带。由于较高激发态通过内转换及转动弛豫回到第一电子激发态的几率较高，18远大于由高能激发态直接发射光子的速度，故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐射激发，电子都从第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能层，所以荧光发射光谱与激发波长无关。（3）镜像规则通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。吸收光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能层形成的。其形状决定于第一电子激发态中各振动能层的分布情况。荧光光谱是激发分子从第一电子激发态的最低振动19能层回到基态中各不同能层形成的。所以荧光光谱的形状决定于基态中各振动能层的分布情况。基态中振动能层的分布和第一电子激发态中振动能层的分布情况是类似的。因此荧光光谱的形状和吸收光谱的形状极为相似。由基态最低振动能层跃迁到第一电子激发态各个振动能层的吸收过程中，振动能层越高，两个能层之间的能量差越大，即激发所需的能量越高，所以吸收峰的波长越短。反之，由第一电子激发态的最低振动能层降落到基态各个振动能层的荧光发射过程中，基态振动能层越高，202122200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱23两个能层之间的能量差越小，荧光峰的波长越长。另外，也可以从位能曲线解释镜像规则。由于光吸收在大约10-15的短时间内发生，原子核没有发生明显的位移，即电子与核之间的位移没有发生变化。假如在吸收过程中，基态的零振动能层与激发态的第二振动能层之间的跃迁几率最大，那么，在荧光发射过程中，其相反跃迁的几率也应该最大。也就是说，吸收和发射的能量都最大。24（三）荧光和分子结构的关系分子产生荧光必须具备两个条件：①分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光；②吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率。251.量子产率荧光量子产率也叫荧光效率或量子效率，它表示物质发射荧光的能力，通常用下式表示=发射荧光分子数/激发分子总数或在产生荧光的过程中，涉及到许多辐射和无辐射跃迁过程，如荧光发射、内转移，系间窜跃和外转移等。很明显，荧光的量子产率，将与上述每一个过程的速率常数有关。吸收的光量子数发射的光量子数262.荧光与有机化合物的结构（1）跃迁类型实验证明，对于大多数荧光物质，首先经历或n（非键电子轨道）激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生或n跃迁而得到荧光。在这两种跃迁类型中，跃迁常能发出较强的荧光（较大的量子产率）。这是由于跃迁具有较大的摩尔吸光系数（一般比n大100-1000倍），其次，跃迁的寿命约为10-7—10-9s，比n跃迁的寿命10-5—10-7s要短。27在各种跃迁过程的竞争中，它是有利于发射荧光的。此外，在跃迁过程中，通过系间窜跃至三重态的速率常数也较小（S1T!能级差较大），这也有利于荧光的发射，总之，跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。（2）共轭效应实验证明，容易实现激发的芳香族化合物容易发生荧光，能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少（仅少数高度共轭体系化合物除外）。此外，增加体系的共轭度，荧光效率一般也将增大。例如，在多烯结构中，ph（CH=CH）3ph和ph（CH=CH）2ph在苯中的荧光效率分别为0.68和0.28。28非荧光性：NNSNH荧光性：NNNH29化合物名化合物结构FEXnmEMnm苯0.11205278萘0.29286321蒽0.46365400丁省0.60390480戊省0.5258064030共轭效应使荧光增强的原因：主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，有利于产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的发生。(3)刚性平面结构实验发现，多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。3132常见发光基团33NNNOHOOOOOOHOCOOH34（4）取代基效应芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。给电子基团，如-OH、-OR、-CN、-NH2、-NR2等，使荧光增强。因为产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。吸电子基团，如-COOH、-NO、-CO、卤素等，会减弱甚至会猝灭荧光。卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。这可能是由所谓“重原子效应”使系间跨越速率增加所致。35（四）溶液的荧光（或磷光）强度1.荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率。If=Ia式中为荧光量子效率，又根据Beer定律Ia=I0-It=I0(1-e-lC)I0和It分别是入射光强度和透射光强度。代入上式得If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)36整理得：If=2.3I0lc当入射光强度I0和l一定时，上式为：If=Kc即荧光强度与荧光物质的浓度成之正比，但这种线性关系只有在极稀的溶液中，当lc0.05时才成立。对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。37（2）影响荧光强度的因素①溶剂对荧光强度的影响。溶剂的影响可分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。一般溶剂效应指的是溶剂的折射率和介电常数的影响。特殊溶剂效应指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用，如氢键的生成和化合作用。38②温度对荧光强度的影响温度上升使荧光强度下降。其中一个原因是分子的内部能量转化作用。当激发分子接受额外热能时，有可能使激发能转换为基态的振动能量，随后迅速振动弛豫而丧失振动能量。另一个原因是碰撞频率增加，使外转换的去活几率增加。③溶液pH值对荧光强度的影响带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光与溶液的pH有关。不同的pH值，化合物所处状态不同，不同的化合物或化合物的分子与其离子在电子构型上有所不同，它们的荧光强度和荧光光谱就有一定的差别。39二、荧光分析仪用于测量荧光的仪器由激发光源、样品池、用于选择激发光波长和荧光波长的单色器以及检测器四部分组成。由光源发射的光经第一单色器得到所需的激发光波长，通过样品池后，一部分光能被荧光物质所吸收，荧光物质被激发后，发射荧光。为了消除入射光和散射光的影响，40荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行。为消除可能共存的其它光线的干扰，如由激发所产生的反射光、Raman光以及为将溶液中杂质滤去，以获得所需的荧光，在样品池和检测器之间设置了第二单色器。荧光作用于检测器上，得到响应的电信号。（1）激发光源在紫外-可见区范围，通常