唾液乳杆菌L生物合成纳米氧化锌的工艺研究

唾液乳杆菌L3生物合成纳米氧化锌的工艺研究摘要：为获得晶体粒径为纳米级别且对致病菌有明显抑菌效果的纳米氧化锌产品，对乳酸菌生物合成纳米氧化锌的工艺条件进行探索。从断奶7~10d健康仔猪的粪便中筛选出一株对高浓度锌离子具有耐受性菌株，并以此菌株为模板，氯化锌溶液为原料，分别研究了作用温度、作用时间、发酵后菌液的pH值、氯化锌原液的添加量四个因素对最终产品氧化锌的粒径、转化率及其对致病菌抑菌效果的影响。研究结果表明，当0.25MZnCl2底物浓度、体系pH值为7.0，70℃水浴温度下作用25min时得到的氧化锌晶体粒径在70nm左右，晶体形状均匀，且对大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌等致病菌的抑菌效果较好，其最小抑菌浓度分别为0.024mg/mL、0.029mg/mL、0.016mg/mL。将纳米氧化锌替代普通锌源添加在动物饲养中能有效改善猪仔生长性能。关键词：乳酸菌；生物合成；纳米氧化锌；粒径；转化率BiosynthesisofZnONanoparticlesbyLactobacillussalivariusL3Abstract:InordertoobtaintheinerraticcrystalofZnOnanoparticles,ZnOnanoparticleswasbiosynthesizedbyusingLactobacillussalivariusL3.LactobacillussalivariusL3strainwasisolatedfromfaecesofhealthyweaningpigletsweanedat7~10dage.Effectoftemperature,actiontime,rawliquorofpHvalueandtheconcentrationofzincsolutiononthesynthesiswereinvestigated.Theoptimumsynthesisfactorsweredeterminedbyorthogonalexperimentasfollows:0.25MZnCl2,pH7.0,waterbathtemperature70℃andreactiontime25minute.Undertheoptimumsynthesisconditions,thesizeofthezincoxidecrystalgrainwerenearby70nm.MeanwhilethecrystalshapewasuniformandhadastrongantibacterialcapabilityagainstE.coli,SalmonellaandStaphylococcusaureus.Theminimuminhibitoryconcentrationwas0.024mg/mLtoE.coli,0.029mg/mLtoSalmonella,and0.016mg/mLtoStaphylococcusaureus.UsingZnOnanoparticlesinsteadofnormalZnOintoanimalfeedwilleffectivelyenhancethegrowthperformanceofweanlingpigs.Keywords:Lactobacillussalivarius;biosynthesis;ZnOnanoparticle;crystalgrainsize;conversionrate纳米材料（nanomateria1）是指结构单元的尺寸在1~100nm、介于宏观物体和原子簇之间的粒子。纳米氧化锌是又称为超微细氧化锌，由于颗粒尺寸处于纳米级别，比表面积急剧增加，使得纳米氧化锌产生了其本体块状材料所不具备的表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应等，因而具有比本体块状材料更强的生物活性。目前，纳米氧化锌的工业化生产方法很多，如沉淀法等，但这些传统方法多为高温高耗能，对环境破坏大[1]。而最近几年来，生物方法制备纳米材料得到了一定的发展，如DNA分子、蛋白质、微生物、动物和植物体[2]等被用来制备纳米材料。Sangeetha,G等用芦荟提取物成功合成纳米氧化锌材料[3]。王娜等用收稿日期：2013-04-14作者简介：胡文锋（1964-），男，博士，副教授，研究方向：应用微生物蛋壳薄膜作为生物活性载体，设计了一种在有生物活性材料参与的条件下室温原位合成硒化铅纳米团簇的新方法。该方法利用蛋膜上特定周期性分布的大分子与无机前驱体离子之间的螯合作用和电荷作用来控制硒化铅微晶的形成、聚集和分布，成功地制备出了具有规则形状的硒化铅纳米团簇[4]。这些生物材料都是由无机成分和特殊的有机基质（蛋白质、脂类或多糖）组成的复合材料，有机基质主要控制无机化合物的形态，即这些无机结构的成核和生长主要由蛋白质和其他生物大分子控制。使用生物体吸附有毒重金属离子，并在细胞内或外将其还原制成纳米材料，这些生物体近来被认为是可能的环境友好型“纳米工厂”。纳米氧化锌不仅在光化学领域有很好的应用，在食品以及动物饲料中也发挥很大作用[5]。目前猪场养殖发现高锌能有效防止断奶猪仔的腹泻问题。将纳米现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2013,Vol.29,No.92193氧化锌替代普通锌源，添加在动物饲养中，其高生物活性、对肠道致病菌的抗菌性[6]和吸收率可以有效地减少腹泻，降低料肉比，而且剂量更少，对环境污染小，为人类健康造福，是目前代替高锌最理想的饲料添加剂[7]，在饲料行业的应用前景广阔。1材料与方法1.1原料1.1.1样品来源1.1.1.1断奶7~10d仔猪粪便样品取自广州温氏集团养殖基地断奶7~10d仔猪粪便，经过实地观察都是健康猪样。1.1.1.2指示菌大肠杆菌O78，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌等由华南农业大学食品学院微生物实验室提供。1.1.2主要仪器设备SM510型高压蒸汽灭菌锅，Yamato有限公司；LRH-250A型生化培养箱，广东医疗器械厂；SW-CJ-2FO型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；GB204型电子天平，瑞典MeltterToledo公司；FEI-Tecnai12分析型透射电子显微镜，荷兰FEI公司；Vertex70傅立叶变换红外光谱仪，德国Bruker公司；恒温摇床培养箱，低速离心机，恒温水浴锅，pH计，磁力搅拌机。1.2方法1.2.1耐高锌乳酸菌的筛选1.2.1.1乳酸菌的富集将采集的断奶7~10d的猪仔粪便加入到灭菌含玻璃珠的高锌液体MRS培养基中37℃恒温静置富集培养24~48h。1.2.1.2乳酸菌的分离纯化与鉴定将富集的菌液进行分离纯化得到多种乳酸菌疑似菌株，并进行形态学和生理生化鉴定试验，同时通过抑菌实验筛选出抑菌效果较好的某菌株进行进一步的16SrRNA序列分析法鉴定。1.2.2纳米氧化锌的生物制备1.2.2.1纳米氧化锌生物制备工艺流程耐锌的乳酸菌培养完成之后调节菌液的pH值，在磁力搅拌器作用下边搅拌边缓慢加入氯化锌溶液，一定温度下水浴孵化一定时间。水浴结束将混合液恒温静置陈化一段时间，最后离心收集产物[8~9]。1.2.2.2纳米氧化锌生物制备工艺条件的优化根据单因素试验结果，选取氯化锌底物浓度、孵化的水浴温度、孵化时间以及孵化时溶液的pH值作为试验因素，设计四因素三水平L9(34)正交试验。通过透射电镜对每组试验得到的产物进行晶体粒径分析，以粒径为指标，通过对结果的极差分析和方差分析确定纳米氧化锌的乳酸菌生物合成优化工艺条件。1.2.3验证试验根据正交试验最佳组合选择乳酸菌合成纳米氧化锌的优化工艺条件，参照上述试验操作流程得到的产物离心洗涤干燥后进行透射电镜分析和红外光谱测试以及产品致病菌抑菌效果的检测[10]，分别测定目标产物纳米氧化锌对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度[11]。并选用普通氧化锌作为对照试验。1.2.4纳米氧化锌含量测定离心收集得到的沉淀中除了目标产物纳米氧化锌外同时还含有少量氢氧化锌沉淀，而氢氧化锌在125℃是能分解成氧化锌和水，利用煅烧前后质量差计算产物中目标产物氧化锌的含量，并根据总锌离子添加量计算出转化率。1.2.5纳米氧化锌晶体的透射电镜分析采用支持膜法，以水作为分散剂将固体粉末产物分散在水中，同时用工作电压为300W的超声波震荡5min，超声结束用滴管吸取一滴滴在支持膜上，晾干后上镜观察。透射电子显微镜工作参数为点分辨率：0.34nm，加速电压100kV，放大倍率50倍~37万倍。1.2.6纳米氧化锌晶体的傅里叶红外光谱分析将生物合成得到的固体产物灰化去除菌体后与KBr按1:100的比例研磨混匀后进行压片，成片后放入样品室扫描检测，仪器工作参数为波数范围：4000~400cm-1，分辨率：4cm-1，扫描次数：32次。1.2.7纳米氧化锌的抑菌试验无菌试管加入近似5×109CFU细菌（致病菌）细胞、5mLMH肉汤液体培养基，添加不同浓度的纳米氧化锌产品。同时取另一支不加菌的试管，其他添加物一致作为对照组。在37℃培养24h，管中细菌细胞没有明显增长的浓度即为纳米氧化锌产品对该致病菌的最小抑菌浓度MIC。2结果与讨论2.1乳酸菌的筛选与分离鉴定2.1.1初步分离与镜检结果经过反复分离纯化，结合镜检，初步分离出四株疑似乳酸菌株，分别命名为L1、L2、L3和L4。其镜检图如图1~图4，表1为这四株菌株的形态学特征。现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2013,Vol.29,No.92194图1L1菌株镜检图（×1000）Fig.1MicroscopicimageoftheL1strain(×1000)图2L2菌株镜检图（×1000）Fig.2MicroscopicimageoftheL2strain(×1000)图3L3菌株镜检图（×1000）Fig.3MicroscopicimageoftheL3strain(×1000)图4L4菌株镜检图（×1000）Fig.4MicroscopicimageoftheL4strain(×1000)表1待检菌株的形态学特征Table1Morphologicalcharacteristicsoftheindeterminacystrains编号菌落形态革兰氏染色个体形态L1乳白色，圆形，边缘完整、光滑、直径0.5~1.5mmG+长杆状，单个或成链L2灰白白色、边缘完整、光滑、直径0.5~2.0mmG+长杆状，无规则排L3白色，边缘完整、光滑、直径0.5~2.0mmG+短杆状，无规则排L4乳白色，圆形，边缘完整、光滑、直径0.5~2.0mmG+长杆状，单个或成链2.1.2乳酸菌的生理生化鉴定结果2.1.2.1乳酸定性试验结果L1、L2、L3和L4四支试管管口的滤纸都变黑，证明有乳酸生成，乳酸转化为乙醛，乙醛受热后挥发，从而导致滤纸条变黑。根据镜检和产乳酸试验，四株试验菌基本符合乳酸杆菌的特征。2.1.2.2待检菌的生理生化特征表2分离菌株的生化鉴定结果Table2Thebiochemicalidentificationresultsoftheseparatedstrains菌株接触酶试验乳酸定性试验需氧试验淀粉水解试验吲哚试验明胶液化试验V-P试验甲基红试验产硫化氢试验运动性试验L1-＋兼性----＋--L2-＋兼性----＋--L3-＋兼性----＋--L4-＋兼性----＋--注：+为阳性反应，-为阴性反应，下同。表3碳水化合物发酵与种的鉴别特征Table3Theidentificationfeaturesofcarbohydratefermentationandspecies菌株葡萄糖产酸葡萄糖产气葡萄糖酸钠乳糖蔗糖木糖山梨醇麦芽糖果糖半乳糖水杨苷纤维二糖L1L2L3L4------------++++++++----++++++++++++++++--------由表2可知，L1、L2、L3和L4菌兼性厌氧；接触酶试验，淀粉水解试验，吲哚试验，明胶液化试验，V-P试验