噬菌体裂解液的制备噬菌体效价测定及转导

噬菌体裂解液的制备、噬菌体效价测定及转导实验原理：溶原性细菌经紫外线照射诱导后，使得原噬菌体从细菌染色体上脱离而进入裂解周期，在宿主细菌细胞内进行复制和组装，形成大量完整的噬菌体粒子。细菌被裂解，释放出游离的噬菌体粒子，通过离心获得噬菌体裂解液。噬菌体的效价是指1ml噬菌体裂解液中所含噬菌体的数目。在含有敏感宿主菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，根据噬菌斑形成单位，进行噬菌体效价测定。转导分为两种类型，即为普遍性转导和局限性转导。本实验为局限性转导，以双重溶源性细菌E.coliK12F(λ)gal+为供体，经紫外线（UV）诱导，在噬菌体裂解液中，将含有两种类型的噬菌体，（λ和λdg），λdg是缺陷噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因（gal），当缺陷性噬菌体λdg再次侵染敏感菌大肠杆菌K12S时，会将发酵半乳糖的基因转移到S菌，使S菌获得gal基因，从而使得S菌获得发酵半乳糖的能力，利用转导子在EMB培养基上发酵半乳糖的特征进行转导频率的计算和分析。实验材料和方法：材料：菌种：E.coliK12F，E.coliK12S，各种方式保藏的微生物菌种，噬菌体裂解液培养基：牛肉膏蛋白胨固体及液体培养基，素琼脂，EMB培养基试剂：氯仿、磷酸缓冲液，无菌水，1%琼脂糖仪器：离心机、UV灯、磁力搅拌器，培养箱，打孔器等实验方法：1、噬菌体裂解液的制备从E.coliK12F菌种斜面上取一环菌种，接种于2mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，离心10min，弃去上清夜，用等体积磷酸缓冲液悬浮细胞，制成菌悬液。将菌悬液加至带有搅拌子的小培养皿中，并将培养皿置于紫外灯下方的磁力搅拌器上，先照射1min后打开皿盖，同时打开搅拌器开关，用紫外线准确照射13s后马上盖上皿盖。处理后加入2mL牛肉膏蛋白胨液体培养基，37℃条件下恒温避光培养2h。取上述已避光培养的培养液4mL，加至无菌离心管中，然后加入0.2mL氯仿，振荡，静置5min后离心10min。并将上清液吸入新的无菌试管中，在4℃冰箱中冷冻备用。2、噬菌体效价的测定将噬菌体裂解液活化后，取0.5mL，用4.5mL/管的牛肉膏蛋白胨液体培养基进行10倍系列稀释至稀释到原液的10-4。将素琼脂培养基融化后向每个试管中加入4mL50℃的素琼脂液体，并向每支试管中加入0.5mLE.coliK12S，振荡使之混合均匀，再分别取10-2、10-3、10-4三个稀释度的噬菌体菌悬液0.5mL介入素琼脂试管中。前后揉搓，使之混匀，立即倒在含有牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板上。倒置与37℃恒温培养箱中培养24h。噬菌体效价计算方法：噬菌体效价/菌体数·mL-1=2m5.0L稀释倍数每平皿平均噬菌斑数3、细菌转导点滴法：倒EMB平板，并如图所示在平板上做好标记，在培养基标记相应处接种相应不同菌种或噬菌体裂解液。结果中能观察倒标记E.coliK12F处长出的菌落为紫色带有金属光泽的菌落，若在λ与E.coliK12S交界处也长出紫色带有金属光泽的菌落，则表明细菌转导成功；若没出现这样的菌落，则表明细菌转导不成功4、转导频率的测定向一支空试管中加入0.5mLE.coliK12S，在37℃恒温培养箱中培养10min。用牛肉膏蛋白胨液体培养基将原液稀释至10-3、10-4，每个稀释度用0.2mL裂解液涂两个平板，在37℃恒温箱中培养48h，观察结果并计算转导频率：转导子/mL=每皿平均转导子数∗稀释度∗20.2mL转导频率=%100m/噬菌体效价转导子L4实验结果：1、噬菌体效价的测定浓度噬菌斑数量10-4(168+172)*2=680噬菌体效价：680*10000*2=136000002、点滴法F菌长出，S菌落长出，F菌比S菌落小，头顶有粉色帽子。在S菌与噬菌体裂解液交汇处，发现有异形菌株，形态与F菌很像。EMB平板上标记λ的三角形处未见菌落，标记F菌处见明显的带金属光泽的深紫色；下图中，实验结果1中标记λ的两个圆有呈现金属光泽的深紫色，实验结果2右侧的圆与S菌交界处菌落呈金属光泽。结果说明噬菌体中的λdg将E.coliK12F(λ)gal+中发酵半乳糖的基因（gal）导入了E.coliK12Sgal-使S菌的菌落在EMB培养基上呈金属光泽。图1:点滴法细菌转导实验结果3、转导频率的测定稀释度转导子数平均数10-419761584178010-4:：转导因子：1780*10000*2/0.2=178000000转导频率：178000000/480000=1309%5分析讨论：噬菌体效价的测定:第一次实验失败，噬菌斑太少，效价不明显。第二次实验结果中是在10-4浓度下效价更加显著，而前两个浓度下的效价依然不是很明显。点滴法：实验效果很好，结果说明噬菌体中的λdg将E.coliK12F(λ)gal+中发酵半乳糖的基因（gal）导入了E.coliK12Sgal-使S菌的菌落在EMB培养基上呈金属光泽。而且呈现金属光泽的菌落数很密集。转导频率的测定：本组实验结果显示转导频率远远超过1，而理论上这种情况不可能发生，推测原因可能由于培养时间过短，没有数出所有噬菌斑，而噬菌斑的数目应远远大于实验所得结果。