华南虎皮肤成纤维细胞离体培养体系的初步建立

华南虎皮肤成纤维细胞离体培养体系的初步建立马勇江1，王兴金2，李玉谷1，黄志宏2，黄勉2，毛三英1（1华南农业大学兽医学院，广东广州510642；2广州动物园，广东广州510642）摘要：简要介绍了华南虎皮肤成纤维细胞的分离培养和冷冻保存。在研究中，采用酶消化法（胶原酶消化：0.1%胶原酶I型＋0.1%BSA；胰蛋白酶消化：0.25%胰蛋白酶＋1mMEDTA）和植块法分离皮肤成纤维细胞。研究结果表明，DMEM/F12(1:1)培养基＋10％FBS＋10ng/mlEGF+5μg／mlInsulin＋100IU／ml青霉素＋100μg／ml链霉素组成的培养体系用于皮肤组织的消化培养和植块培养，胶原酶消化法和植块法成功获得华南虎皮肤成纤维细胞。用10％DMSO＋20％FBS＋70％DMEM/F12培养基组成的冷冻保存液对细胞进行冷冻保存，解冻后获得91.1％的活率，解冻细胞再次培养能正常生长。关键词：华南虎；成纤维细胞；体外培养；皮肤华南虎(Pantheratigrisamoyensis)为我国特有的珍稀濒危动物，其保护拯救工作已引起了国内外有关组织、机构和专家、学者的高度重视。但与国内对大熊猫的保护拯救取得了举世瞩目的成就相比，国内对华南虎只进行了一些极为初步的基础研究。目前，国内在以精子库、卵子库、胚胎库、体细胞库等为主要内容的华南虎基因资源保存库建设方面的工作才刚刚开展（韩宗先，2004），有关华南虎体细胞库建立方面的研究尚为空白。利用细胞离体培养技术，分离培养华南虎皮肤成纤维细胞不仅可以使华南虎的遗传资源得到长期保存，而且可以为研究者提供丰富的研究材料，在细胞水平上研究华南虎基因资源保护问题。本文扼要地介绍了华南虎皮肤成纤维细胞的离体培养体系和冷冻保存方法。1材料与方法1.1主要试剂DMEM/F12(1:1)培养基（Gibco公司，11330），胶原酶Ⅰ型（Sigma公司，C0130），PBS缓冲液（Gibco公司），胰蛋白酶(Amresco公司，0458，Lot.#2006B014)，牛血清白蛋白(BSA；Roche公司)，EDTA(Amresco公司，0105)，表皮细胞生长因子（EGF；PeproTech公司，Cat.#100-15），胰岛素（insulin；Sigma公司，I5500），四甲基偶氮唑盐（MTT；Sigma公司），二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)，青链霉素（TBD公司），胎牛血清（FBS；Gibco公司），台盼蓝（Sigma公司）。1.2实验方法1.2.1皮肤组织的采集华南虎（15岁，雄性，广州市动物园）麻醉后，虎尾中段背侧剃毛消毒(碘酒消毒后立即用75％的酒精脱碘)后，用止血钳夹起皮肤，再用手术刀片切割夹起的皮层，取大小约为1.0×0.5cm2皮肤块，然后迅速将其放人含高浓度青链霉素（500IU／ml青霉素＋500μg／ml链霉素）的PBS缓冲液中，置4℃冰盒中带回实验室进行分离培养。从采样到分离培养，时间最好不要超过12h。1.2.2皮肤成纤维细胞的分离将华南虎皮肤组织块在含青链霉素（100IU／ml青霉素＋100μg／ml链霉素）的PBS缓冲液中洗涤数遍，去血污及毛发，然后剪成1mm3大小的小块，再用上述PBS缓冲液清洗至液体清亮，静置，去上清，分成4份用于以下不同的分离培养方法。胶原酶消化法：在37℃下用胶原酶消化液（0.1%胶原酶I型＋0.1%BSA）持续酶解30min～1h，期间振荡4-5次，待皮肤组织呈絮状时，用等体积培养液（DMEM/F12(1:1)培养基＋10％FBS＋100IU／ml青霉素＋100μg／ml链霉素）中止酶解，吸管吹吸打散，200目筛网过滤，1000rpm离心洗涤滤过液1～2次。细胞团用完全培养液（DMEM/F12(1:1)培养基＋10％FBS＋10ng/mlEGF+5μg／mlInsulin＋100IU／ml青霉素＋100μg／ml链霉素）重悬，血球计数法测量细胞密度，按2×105/60mm培养皿细胞密度，在饱和湿度，5％CO2，37℃的CO2培养箱中进行培养。胰蛋白酶消化法：在37℃下用胰蛋白酶消化液（0.25%胰蛋白酶＋1mMEDTA）持续酶解20min～40min，或4℃下过夜消化，其它步骤同胶原酶消化法。植块法：将皮肤组织小块移人六孔板（Corning，353014），每孔3～4块组织小块，用微量移液枪在组织小块的周缘滴加微量完全培养液，在饱和湿度，5％CO2，37℃的CO2培养箱中培养2h，之后再加少量完全培养液（不浸没组织块）继续培养24h，最后加完全培养液浸没组织块。之后每2d更换2／3的培养液。1.2.3传代培养与皮肤成纤维细胞的纯化上述分离方法得到的细胞在铺满皿底80％～90％时，用胰蛋白酶消化液消化，按1:2~3的比例或1×104/cm2细胞密度进行传代培养。在传代培养过程中，根据上皮类细胞和成纤维细胞贴附能力和贴壁所需时间的不同，即消化时容易脱壁和接种后贴壁快的细胞主要是成纤维细胞的特点，对皮肤成纤维细胞进行纯化。具体做法是：在倒置显微镜下观察贴壁细胞消化情况，当大部分梭形细胞胞体变圆时，中止消化，未脱壁细胞丢弃；传代接种细胞4～6h后，未贴壁细胞丢弃；经2～3次传代之后，皮肤成纤维细胞即可被纯化。1.2.4皮肤成纤维细胞生长曲线的测定取第2代、第5代和第9代的细胞，胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度为5×104/ml，加入96孔板（Corning，353014），每孔200μl，每组设3个重复孔。空白对照不加细胞只加培养液。于培养20h（1d）、44h（2d）、68h（3d）、92h（4d）、116h（5d）、140h（6d）、164h（7d）、188（8d）、212（9d）和236（10d）后，每孔加入MTT（5mg/ml）20μl，继续培养4h。吸弃上清液,加入150μlDMSO。在震荡器上轻轻震荡15min后，立即利用检测波长为490nm，参考波长为630nm的酶标仪（Bio-Red680型）测OD值。以每天测得的OD值平均值为横轴，细胞培养天数为纵轴绘制细胞生长曲线。1.2.5细胞冷冻保存和复苏用冷冻保存液（10％DMSO＋20％FBS＋70％DMEM/F12培养基）调整细胞浓度为1×106/ml，每只冻存管1ml分装，按程序（4℃下平衡30min，液氮面熏蒸2h后，浸入液氮）冷冻细胞。解冻时，迅速从液氮中取出冻存管，立即用40℃温水快速解冻，冻存管用75％酒精消毒，将细胞移入10ml离心管中，补加9ml培养液，离心洗细胞1～2次；0.4％台盼蓝测细胞活率后，用完全培养液进行培养。2结果与分析2.1皮肤组织的分离效果利用0.1%胶原酶I型＋0.1%BSA构成的胶原酶消化液可从华南虎皮肤组织中成功获取单个细胞（如图1），但获取的细胞不纯，主要为两类细胞：成纤维细胞和上皮样细胞（如图2），成纤维细胞成梭形长条状或不规则状，上皮样细胞多呈形态较为规则的椭圆形或三角形，表明胶原酶消化法可用于分离华南虎皮肤组织细胞。采用0.25%胰蛋白酶＋1mMEDTA构成的胰蛋白酶消化液，不管是37℃热消化还是4℃冷消化，获取的细胞数量很少，且细胞活率不好，表明胰蛋白酶消化法不宜用于分离华南虎皮肤组织细胞。植块培养的皮肤组织块在培养5～8d左右可看见梭状的成纤维细胞从组织块周围游离出(如图3、图4)，培养12～14d左右组织块周围可见密集排列的梭状成纤维细胞，上皮样细胞极少见(如图5)，可知植块培养获得原代细胞主要为成纤维细胞。胰蛋白酶消化传代组织块周围成纤维细胞后，培养2～4d左右组织块周围又可见梭状成纤维细胞。再消化传代1～2次后（即收获1～2次成纤维细胞），组织块开始游离出一种折光性强的小球形细胞(如图6)。随着培养时间的延长，一些小球形细胞分化为上皮样细胞（角质形成细胞），另一些分裂增殖聚集成团(如图7)。随着培养时间的进一步延长，所有的小球形细胞均分化为上皮样细胞（角质形成细胞）(如图8)，上皮样细胞短暂增殖后空泡化（角化细胞）。2.3成纤维细胞的传代培养与纯化胶原酶酶解分离得到的混合细胞，经过连续2－3次差速贴壁传代后可获得纯的成纤维细胞(如图9、图10)；植块法早期获得的细胞为成纤维细胞，不需传代纯化。2.4细胞生长曲线华南虎皮肤成纤维细胞的生长曲线如图11。由图可知细胞生长的潜伏期约24－72h，增殖期约120h，平台期和衰退期区分不明显，细胞数量呈波动下降状态。2.5细胞冷冻保存和复苏冷冻保存前用0.4％台盼蓝染色拒染法测得细胞活率为94.2％，冷冻保存3月年后，取出解冻、洗涤后测得细胞活率为91．1％，经显著性检验，差异不显著。解冻后的细胞接种培养后，细胞形态未发生变化，细胞生长状况良好。3讨论3.1关于华南虎皮肤成纤维细胞的分离方法与效果皮肤成纤维细胞是存在于真皮及其皮下结缔组织中的一类细胞，在体外培养时增殖较快，要求的培养条件相对容易，因此本研究分离培养成纤维细胞为主。已报道关于皮肤成纤维细胞分离方法主要有酶消化法（主要为胰蛋白酶和I型胶原酶）和植块法。利用这些方法，已成功分离得到大熊猫、牛、羊、马、猕猴等多种动物以及人的皮肤成纤维细胞（刘冀珑等，1999；韩军涛等，2000；李煜，2001；邓明安等，2001；杨彩侠等，2004；张明等，2004；张明等，2005a，2005b和2005c；陈洋等，2006；张明等，2006）。目前，华南虎皮肤成纤维细胞的分离培养国内外未见报道，因此本研究亦采用上述方法分离华南虎皮肤成纤维细胞，但只有I型胶原酶消化法和植块法分离得到较多成纤维细胞，而胰蛋白酶消化法分离效果不好，细胞少，活率差。一方面可能还没有摸索到胰蛋白酶最适消化时间和酶浓度，另一方面可能与所采取的华南虎皮肤组织结构组成有关。从成功分离得到大熊猫、牛、羊、马、猕猴等多种动物的研究报告来看，他们大多采集耳尖皮肤组织或腹股沟皮肤组织，这些部位皮肤角化程度低、皮薄，更有利于皮肤成纤维细胞的分离培养。由于一些客观因素，我们只采集到华南虎尾部中段背侧皮肤组织块，利用冰冻切片技术，我们观察到这些皮肤组织角化严重，表皮大约厚1mm，角化复层扁平上皮只有2－4层细胞；真皮及其皮下结缔组织厚约5－6mm，胶原成分十分发达，细胞分布于胶原纤维间（成纤维细胞）和毛囊（上皮样细胞）处，血管少（如图12、图13、图14和图15）。从华南虎皮肤组织结构来看，胰蛋白酶很难消化华南虎皮肤组织，而胶原酶更适合分离培养华南虎皮肤组织细胞；也可进一步说明本研究中植块法华南虎皮肤组织细胞的迁移（游离）规律：更易游离出来的成纤维细胞先出现，上皮样细胞后出现。植块法可分离得到高纯度的华南虎皮肤成纤维细胞，且对细胞无损害。因此，与酶消化法对分离细胞有一定程度损害相比，植块法更适合华南虎皮肤成纤维细胞的分离和原代培养。3.3关于华南虎皮肤成纤维细胞的增殖潜力研究表明，动物的年龄、取材的部位等因素，会影响细胞生长、增殖速度和潜力。一般动物年龄越小．细胞的增殖越快，增殖潜力越强；取材部位组织的再生能力越强、越幼嫩，角化程度越低，细胞的增殖速度越快，增殖潜力越强。从本研究测得的不同代次华南虎皮肤成纤维细胞生长曲线来看，传代次数越多，细胞增殖能力呈下降趋势；与已报道的其它动物皮肤成纤维细胞的增殖能力相比，本研究所分离培养的华南虎皮肤成纤维细胞增殖能力不强，第10代细胞已呈现较为明显的衰老，表现为传代时间延长，细胞折光性不强，细胞空泡化。这可能与取材华南虎年龄大、取材部位角化程度高有关。3.3关于华南虎皮肤成纤维细胞的培养体系与冷冻保存作为遗传资源保存的细胞系，遗传稳定性是极其重要的。寻找尽可能能够维持遗传资源保存细胞系的遗传稳定性的培养体系，是遗传资源保存细胞建系研究的重点。本研究参考已报道的动物皮肤成纤维细胞培养方法（刘冀珑等，1999；韩军涛等，2000；李煜，2001；邓明安等，2001；杨彩侠等，2004；张明等，2004；张明等，2005a，2005b和2005c；陈洋等，2006；张明等，2006），对华南虎皮肤成纤维细胞培养体系进行了筛选，如培养基（DMEM