博士专题基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术.

博士专题：基因功能研究技术之——基因敲除、基因编辑技术刘惠荣内蒙古农业大学生命科学学院II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失•基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变细胞遗传特性的目的。•传统的基因敲除技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体的随机交换，但在体细胞内，基因同源重组的效率特别低（低于10-6），增加了实际操作的工作量，限制了该项技术的应用。1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型，此后基因敲除技术得到进一步的发展和完善，目前该技术已经成为研究基因功能最直接、最有效的方法之一。•基因敲除技术分为完全基因敲除、条件型基因敲除、诱导型基因敲除。•完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或动物个体中的靶基因活性。•条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。•诱导型基因敲除是通过对诱导剂给予时间的控制，在动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行敲除的技术。•基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。（一）完全基因敲除基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制：有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。（二）条件型基因敲除•条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。•该系统在80年代被引入后，已成功被应用于酵母菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。•现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。Cre-LoxP重组酶系统•Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件型基因打靶、诱导型基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。Cre-LoxP重组酶系统•Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现，属于λInt酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质。Cre重组酶是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白。它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的DNA序列，即loxP位点，使loxP位点间的基因序列被删除或重组。Cre重组酶有70%的重组效率，不借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA。Cre-LoxP重组酶系统•LoxP（locusofX-overP1）序列：来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下：•5'-ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-3'•3'-TATTGAAGCATAT-TACATACG-ATATGCTTCAATA-5'•Cre-LoxP系统的特性条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。它实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。Cre/loxP系统作用原理示意图FLP／FRT系统•该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶和一段特殊的DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP系统在真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成分Flp识别位点(Flprecognitiontarget，FRT)与loxP位点非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8bp的核心序列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了目的片段的缺失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp重组酶为30℃。因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP和FRT位点的序列如图所示这一技术亦存在一些缺点：1.费用太高2.周期较长3.许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这些基因的功能为其他基因代偿所致条件型基因打靶的优势：1.克服了重要基因被敲除所导致的早期致死2.并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及疾病发生、治疗过程中的作用和机制（三）诱导型基因敲除•诱导型基因敲除法也是利用Cre/Loxp系统为基础，利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制从而在动物的一定发育阶段和组织细胞中实现对特定基因的敲除。•由Cre/Loxp系统和诱导系统两个部分组成。Loxp转基因动物是用常规基因打靶技术构建成的，基因组中待修饰区域两端各携带1个Loxp位点的转基因动物。诱导系统是指所携带的Cre基因的表达或所表达的Cre的酶活性具有可诱导性的转基因动物。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计来对动物基因敲除的时空特异性进行人为控制，以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。•常见的几种诱导型基因敲除类型有：四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。III、基因编辑技术•ZFN系统•TALEN系统•CRISPR/Cas系统（一）ZFN技术系统ZFN技术原理锌指核酸酶（Zinc-fingernucleases,ZFN）是人工改造的限制性核酸内切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。•锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别3-4个碱基；•人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采用如上的通用序列，通过改变其中7个X来实现识别不同的三联体碱基，TGEK是多个螺旋间的连接序列；•构建成对人工锌指结构域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定区域切断DNA双链。•单个ZFN的DNA结合结构域一般包含3-6个Cys2-His2锌指结构域，每个锌指结构域能特异识别1个三联体碱基，与锌指蛋白相连接的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端96个氨基酸残基组成的DNA剪切域，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，但2个识别位点相距6-8bp距离时，2个单体ZFN相互作用产生酶切功能。在此特异位点产生1个DNA双链切口，然后利用固有的同源重组或非同源末端连接修复机制进行切口修复。从而达到对精确位点进行定点修饰的目的。ZFN技术锌指核酸酶介导的定向染色体删除研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因敲除。已建立有ZFN库，识别多种DNA序列，但还不能达到识别任意靶DNA的目的，其应用受到一定的限制。•ZFN技术已成功应用于黑长尾猴、大鼠、小鼠、中国仓鼠、斑马鱼、果蝇、海胆、家蚕、拟南芥、烟草、玉米、猪、牛、人类iPS细胞等，此外，该技术已经有用于治疗HIV的ZFN药物进入二期临床实验。•但是，该技术制备复杂，成本昂贵，而且其技术专利被少数几家商业公司控制。（二）崭新的技术-TALEN经典的挑战–染色体DNA序列的人工编辑修改•（点）突变：Silent；Missense；Nonsense；Frameshift（基因敲除，Knockout）•片段删除•片段插入目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗崭新的技术解决经典的挑战靶向基因技术•经典方法：–自杀质粒，同源重组–几率低(~1HReventper106cells），难！•饱含希望与失望的技术：–ZFN，被Sigma公司垄断•新的里程碑：–TALENTALEN技术基于TALEN(transcriptionactivator-like(TAL)effectornucleases，类转录因子效应物核酸酶)的靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大鼠等各类研究对象。技术原理：表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别靶点核酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程。•1989年植物病原体黄单胞菌属（Xanthomonasspp.）avrBs3基因被克隆。•2007年发现其序列特异性核酸结合特性，avrBs3–TA•2009年XanthomonasTA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译由34个aa组成一个单元模块，重复17-18次34个aa中的第12和13个氨基酸（RepeatVariantDi-residue,RVD)对应识别一个目标碱基TALEN发展过程人工构建TALE模块识别指定核酸序列102碱基模块单元……14–18个重复真核表达……14–18个重复特异识别指定的14-18个核酸序列并与之结合34氨基酸单元TALEN发展过程TALEN(TALE+FOKI)表达质粒对TALEN基因敲除FokITAL靶点识别模块FokIFokITAL靶点识别模块X2TALEN表达质粒对转染、表达切割靶位点切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologousend-joining，NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体TALEN介导的同源重组同源重组发生率升高几个数量级DonorplasmidHRDonorplasmidLeftarmRightarmDonorplasmidLeftarmRightarm点突变片段删除基因敲入2011年8月，NatureBiotechnology上同时发表了用TALEN技术进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。•一篇人类干细胞《GeneticengineeringofhumanpluripotentcellsusingTALEnucleases》•一篇大鼠《KnockoutratsgeneratedbyembryomicroinjectionofTALENs》•两篇斑马鱼《TargetedgenedisruptioninsomaticzebrafishcellsusingengineeredTALENs》《HeritablegenetargetinginzebrafishusingcustomizedTALENs》•一篇综述《MoveoverZFN》TALEN的最前沿TALEN靶向（基因敲除）技术基本流程1.选择、确定靶点2.TALE识别模块串联构建3.TALEN真核表达质粒构建4.TALEN真核表达质粒转入（卵）细胞，表达TALEN重组蛋白5.检测突变效率，筛选（移码）突变体X2X2X2MutMut靶点的DNA序列特征：相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点参考文献：Cermaketal.,EfficientdesignandassemblyofcustomTALENandotherTALeffector-basedconstructsforDNAtargeting,NucleicAcidsResearch,2011,Vol.39,No.12,e82.在线靶点选择设计软件：选择确定TALE靶点•TAL的核酸识别单元为34aa模块中的双连氨基酸（RVD）•RVD与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NI识别