土壤中分解尿素细菌的分离与计数学案

1土壤中分解尿素细菌的分离与计数学案一、研究思路1．筛选菌株(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于________________生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时________或________其他微生物生长。(2)选择培养基：在微生物学中，将允许__________种类的微生物生长，同时________或________其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。(3)分离分解尿素的细菌的选择培养基：①在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是____________，提供氮源的是________，琼脂的作用是凝固剂。②该培养基对微生物具有选择作用。其选择机制是___________才能在该培养基上生长。③土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们体内能合成________，将尿素分解的反应式是________________________________________________________。Taq细菌能忍受93℃左右的高温，是在美国黄石国家公园的一个热泉中发现的，这说明，在寻找目的菌株时，要根据____________________________________________。2．统计菌落数目的方法(1)稀释涂布平板法(也叫活菌计数法)①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的____________，通过统计平板上的________，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②操作：第一，设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择________稀释度的菌液，分别取0.1mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布整个平板表面，放在适宜的温度下培养并计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度涂布到三个或三个以上的平板上，培养并计算出__________。第二，为了保证结果准确，一般选择菌落数在________的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。③计算公式：每克样品中的菌株数＝CV×M，其中C代表___________________________，V代表________________________________(mL)，M代表____________。(2)显微镜直接计数法①原理：此法利用特定的____________或______________，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1mm2和高0.1mm的计数室，在1mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，计数室由________个小格组成。②操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。③计数公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数。(3)设置重复和对照①设置重复：培养过程中应设置重复组，同一稀释度下应涂布________个平板，才能增强实验的说服力与准确性。②设置对照：实验中应设置对照，主要目的是________________________对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。如__________对照组，观察培养物中是否有杂菌污染；设置________培养基，观察选择培养基是否具有________作用。二、实验设计（实验步骤）1．土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中，用无菌小铁铲铲去表层土3cm左右，迅速取土壤并装入____________密封或事先准备好的________中。2．制备培养基：①制备________________培养基作为对照组，尿素为唯一氮源的培养基作为________，用来判断选择培养基是否具有____________。②放宽稀释范围，如稀释倍数为103～107范围内的要分别涂布，而每个稀释度下需要______个选择培养基、________个牛肉膏蛋白胨培养基，因此需要15个选择培养基和5个牛肉膏蛋白胨培养基。③两种培养基应各有一个作为________对照，此外还需准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。3．样品的稀释与涂布平板：参考下面的实验流程示意图，将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的2锥形瓶中(锥形瓶体积为250mL)，充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有________mL生理盐水的无菌大试管依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取______mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。说明：图中的1、2、3平板是____________，4为____________________作对照，判断选择培养基是否具筛选作用，还有两个空白对照，即不涂布稀释后菌液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，验证培养基中是否____________。4．将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养，及时观察和记录。5．挑选选择培养基上不同形态的菌落接入含____________培养基的斜面中，观察能否产生颜色反应。6．细菌的计数：当菌落数目稳定时，选取菌落数在________的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出____________，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。同时仔细观察所分离到的菌落，并记录菌落特征。7．统计表格表一平板上的菌落数记录表稀释倍数10310410510610712341234123412341234123⋮表二菌落特征记录表注：一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，____________表现出________的菌落特征。三、操作提示1．取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要________。2．应在________旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入________中，塞好棉塞。3．在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在________旁操作。4．实验时要对________做好标记。注明______________________________________等。5．为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当________________。四、结果分析与评价内容结论分析有无杂菌污染的判断对照的培养皿中________菌落生长→未被杂菌污染培养物中菌落数________→被杂菌污染菌落形态多样，菌落数偏高→培养物中混入____________选择培养基的筛选作用牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目________选择培养基的数目→选择培养基具筛选作用，已筛选出一些菌落样品的稀释操作得到2个或2个以上菌落数目在________的平板→操作成功，能进行菌落的计数重复组的结果若选取同一种土样，统计结果应________；如果结果相差太远，说明实验操作过程中出现操作失误，需要找出产生差异的原因五、课题延伸在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的________将尿素分解成了________。氨会使培养基的碱性增强，________升高。因此，我们可以通过检测培养基____________来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入________指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将________，这样，我们就可以准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。土壤中分解尿素细菌的分离与计数学案答案一、1.(1)目的菌株抑制阻止(2)特定抑制阻止(3)①葡萄糖尿素②只有能够以尿素作为氮源的微生物③菌落种类形状大小隆起程度颜色……123⋮3脲酶CO(NH2)2＋H2O――→脲酶CO2＋2NH3它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找2．(1)①一个活菌菌落数②三个菌落平均数30～300某一稀释度下平板上生长的平均菌落数涂布平板时所用的稀释液的体积稀释倍数(2)①细菌计数板血细胞计数板400(3)①至少3②排除实验组中非测试因素空白完全筛选二、1.(1)无菌信封烧杯(2)①牛肉膏蛋白胨实验组选择作用②31③空白(3)90.1选择培养基牛肉膏蛋白胨培养基含有杂菌(5)酚红指示剂(6)30～300平均值(7)同种微生物稳定三、1.灭菌2.火焰锥形瓶3.火焰4.培养皿培养基类型、培养时间、稀释度、培养物5.事先规划时间四、无偏高其他氮源大于30～300接近五、脲酶氨pHpH的变化酚红变红