土壤中放线菌的分离与纯化

-1-土壤中放线菌的分离与纯化实验目的1掌握放线菌的生长特性，微生物的培养方法。2掌握微生物实验的基本生物技术，主要包括无菌操作技术，纯种分离技术，纯种培养技术，以及抗生素检测等。3掌握合成培养基，选择培养基的制备方法。4学习对微生物实验的中出现问题的分析，解决方法实验材料药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、琼脂、重铬酸钾其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。实验原理放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。放线菌可以产生抗生素，抑制其他菌种的生长，故可用金黄色葡萄球菌（G+）和大肠杆菌（G-）作指示菌鉴别放线菌。高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O作为无机盐，FeSO4•7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成1.高氏一号合成培养基的制备K2HPO4•3H2O0.125g，可溶性淀粉5g，硝酸钾0.25,MgSO4•7H2O0.125g，FeSO4•7H2O0.025g，氯化钠0.125g，琼脂5g，水250ml。-2-配制时，先依次加入上述药品（除琼脂外）顺序溶解，加入无菌水至250ml，调节pH＝7.4，再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后，121℃灭菌20分钟。将6套平皿、12只试管灭菌。2.土壤中放线菌的分离1．编号，分装：取6套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-3、10-4、10-5）。每个稀释度做两个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷凝至50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右，待冷凝成平板。另取5支盛有9ml一只盛有10ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。2．稀释倾注分离称1g土样放入10ml无菌水试管中振荡10min，即10-1的土壤悬液，静置30s。用无菌吸管无菌操作取10-1浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-2的无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。即为10-2浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。3．倒平板分离培养于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的高氏培养基约10—15ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固。（若融化的培养基温度太高，会产生太多的冷凝水，影响观察。）-3-用1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。用无菌涂布棒（从浓度小液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌。稀释涂布平板法4培养接种完毕，将平皿和试管放入28℃恒温箱培养7天，观察平皿上放线菌（主要是链霉菌）菌落。菌种纯化1、倒平板将加热融化的高氏一号合成培养基倒平板，并标号。2、平板划线划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种：图Ⅴ-3划线分离示意图⑴分区划线用接将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁刮取少许菌苔，在平板培-4-养基的一边，作第1次平行划线6～7条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线(图Ⅴ-3)，然后再用同样方法，作第3次平行划线。划线时，接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。⑵连续划线将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线(图Ⅴ-4，B)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置28℃培养。V—4划线分离示意图拮抗实验长出菌落后，要判断是否已分离到了纯菌种。1配置鉴别培养基配置金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养基。2标号在两平板上标注均匀间隔的7个区域。2挑菌落在纯培养的平板上切取生长较好的放线菌落依次放入标注区域中（在火焰旁切取），置于28℃恒温箱培养1天后可观察到有抑菌圈生成。-5-讨论1高氏培养基的配置关键是pH值的调节和重铬酸钾的加入。放线菌的最适生长条件是23~37，pH7.0～7.5，而在同样条件下也利于霉菌生长。在高温杀菌下，放线菌和霉菌的孢子仍可以存活，所以必须加入重铬酸钾抑制霉菌和细菌的生长（对放线菌无抑制作用）。否则霉菌大量生长。培养基配置时各成分的溶解顺序应是先加缓冲化合物，后是主要元素、次要元素。调节pH值时，加入酸碱要缓慢、少量、多加搅拌，防止局部过酸或过碱而破坏营养成分。我们第一次配置的高氏培养基很可能就是由于酸碱调节时酸碱过量和未加入重铬酸钾而导致失败。2放线菌可以产生色素，且放线菌代表属也分好几种。其菌落一般为圆形，菌落质地致密表面呈较紧密的绒状或坚实、干燥、多皱，地衣状。表面干燥。可作为鉴别菌种的基本参考依据。孢子丝生长到一定阶段可形成孢子由于孢子含有不同色素，成熟的孢子堆也表现出特定的颜色，而且在一定条件下比较稳定，故也是鉴定菌种的依据之一。但孢子的形态和大小不能笼统地作为分类鉴定的重要依据。3整个过程要保证在无菌条件下进行，培养基及仪器可用高压蒸汽灭菌。接种时，实验桌要用95％的酒精擦拭，且在接种时要在火焰区的无菌范围内（空气中含有大量灰尘、细菌和霉菌孢子等造成污染），且打开培养基时间尽量短。4稀释倒平板法时涂布要均匀，否则，细菌密度不均导致菌落生长过于集中，细菌无法充分利用营养成分影响生长，且在鉴别时较难看到明显的抑菌圈。稀释时除了应用平板涂布外还用了划线法。涂布主要是通过稀释溶液方法减少细菌分布密度，划线法通过多次划线逐渐被稀释，最后可得到单独存在的菌落。5放线菌是产生抗生素最多的菌种，其可以抑制金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌是临床上常见的致病菌，且耐药性很普遍，可通过观察其对金黄色葡萄球菌的抑制产生的抑菌圈辨别菌种。放线菌的接种方法同细菌，多用密状蜿蜒划线法，以获得大量菌体细胞，观察孢子颜色。