利用水分胁迫筛选葡萄抗旱砧木

利用水分胁迫筛选葡萄抗旱砧木郭志龙(镇原县农业技术推广中心，甘肃庆阳744500；联系人E-mail:[e-mail])摘要:以盆栽变叶葡萄、贝达、5BB的一年生扦插苗为试材,通过控水胁迫研究了葡萄叶片的脯氨酸、丙二醛、质膜透性、叶绿素含量的变化。结果表明：土壤相对含水量为85％(ck)、70％、50％、30％条件下，变叶葡萄、贝达、5BB叶片的脯氨酸、丙二醛含量、质膜透性随着土壤水分的减少而增加，叶绿素含量随着干旱程度的加重而减少。通过综合生理指标分析：变叶葡萄抗旱性较强，贝达和5BB耐旱性较弱。关键词:葡萄；水分胁迫；生理指标；抗旱砧木葡萄属于葡萄科（Vitaceae）葡萄属（VitisLinn）植物，是一种栽培价值很高的果树。葡萄在世界果树生产中栽培面积和产量仅次于柑橘，在国际果树生产中占有重要地位[1]。由于葡萄的适应性强、分布广、产量高、营养丰富，有很高的经济价值，所以需要更多的品种来适应不同的环境和地域。葡萄是世界第三大果树树种，是果品及其加工产品中效益最高的大宗果品之一。冬春多雨夏季干燥的地中海式气候是最有利于葡萄营养生长和品质发育的生态条件，尽管葡萄是一个比较耐旱的果树树种，但夏季频发的干旱高温也常威胁到葡萄的正常生长，而我国葡萄主产区以干旱半干旱气候为主，大陆性季风气候不但导致常年冬春干旱，夏季高温干旱或秋旱也时常发生，西北大多数地区干旱、少雨、空气干燥，水分胁迫使葡萄生长发育产生生理障碍,降低葡萄产量，影响葡萄浆果品质及葡萄酒品质，是制约葡萄与葡萄酒产业发展的重要环境因子[2-6]。有关水分胁迫对果树[3,4,7-12]光合作用的影响均有很多。旱作栽培技术虽然在一定程度上能够在部分旱区进行葡萄的生产，但土壤水分是优质、丰产栽培的基本保障，在干旱或水分不足地区筛选种植较耐旱的品种，配合旱作栽培技术，对于调整旱区农业种植结构、农民增收具有重要的经济和生态意义。试验研究对变叶葡萄、贝达、5BB三种抗旱砧木进行盆栽，通过水分胁迫过程中葡萄叶片的脯氨酸、丙二醛、质膜透性、叶绿素含量的变化，以探讨水分对不同抗旱砧木的生理影响，进而为葡萄抗旱栽培提供理论依据。1材料与方法1.1材料试验材料为变叶葡萄、贝达、5BB三种抗旱砧木的一年生扦插苗，盆直径44cm,高32cm。3月下旬每盆装配土(表土:沙子=1:2)24kg，每盆扦插3株。每个砧木栽15盆于甘肃农业大学的现代温室中，栽植后管理条件一致，正常浇水，以保证各盆土壤水分状况一致或相近。待苗木长到7-8片叶时，每个砧木选取12盆进行水分胁迫处理。1.2方法1.2.1水分胁迫采用定量控制浇水的方法，用称重法控制土壤相对含水量[13]土壤相对含水量(SRWC)是占田间最大持水量的百分数。最大持水量的标定是傍晚时浇水，当水从盆底流出时停止浇水，然后晾一夜，次日上午用烘干法测定土壤含水量，以此时测定的土壤相对含水量作为100％。试验中每天对盆栽苗进行称重获得日失水量，用以补充调节水分[14]。SRWC(％)＝(土壤重量－土壤干重)/(土壤饱和重量－土壤干重)。1.2.2干旱处理分为3种轻度水分胁迫SRWC为70％；中度水分胁迫SRWC为50％；严重水分胁迫SRWC为30％；CK正常浇水SRWC为85％。处理以盆为对象，每个砧木处理各重复3次。水分胁迫10d后，采集各砧木不同处理的盆栽苗基部以上第4叶片，进行脯氨酸、质膜透性、丙二醛、叶绿素含量四项生理指标的测定。1.2.3脯氨酸（Pro）含量的测定取7支具塞试管按表一加入各试剂，混均后加玻璃球塞，在沸水中加热40min，取出冷却后向各管中加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质，待静置分层后吸取甲苯层一“0”管为对照在波长520nm下比色。以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标绘制标准曲线，球线性回归方程。各称取剪碎的葡萄砧木叶片0.5g，分别置于大试管中，重复三次，加入5ml3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球于沸水浴中浸提10min。然后取出试管待冷却到室温后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml2.5%酸性茚三酮显色液雨沸水浴中加热40min，取出冷却后向各管中加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质，待静置分层后吸取甲苯层一“0”管为对照在波长520nm下比色。从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸的含量。脯氨酸(ug/g)=(c*v/a)/w式中：c-提取液中脯氨酸浓度(ug)，由标准曲线求得；v-提取液总体积(ml)；a-测定时所吸取的体积(ml)；w-样品重。表一各试管中试剂加入量管号0123456标准脯氨酸含量（ml）00.20.40.81.21.62H2O(ml)21.81.61.20.80.40冰乙酸（ml）2222222酸性茚三酮显色液（ml）3333333脯氨酸含量（ug）03481216201.2.4质膜透性的测定分别在正常生长和干旱胁迫的植株上取同一叶位的叶片若干，用蒸馏水冲洗两次，再用洁净的滤纸吸净表面水分，然后用打孔器每组叶片打取30片（避开主脉），分装在3支洁净的刻度试管中，每管放10片。然后向各试管中加入10ml蒸馏水，并将大于试管口径的塑料纱网放入试管距离液面1cm处，以防止叶圆片在抽气时翻出试管，然后将试管放入真空干燥箱中用真空泵抽气20min以抽出细胞间隙的空气，当缓缓放入空气时，叶片变成透明状，沉入水下。让其在室温下振荡1h，用电导仪测其初电导值S1，测毕将各试管盖塞封口，置沸水浴中10min，以杀死植物组织，取出试管用自来水冷却至室温，并在室温下平衡10min，摇均测其终电导值S2。试验中应用蒸馏水做空白对照。相对电导度（L）=（S1-空白电导度）/（S2-空白电导度）伤害度=(Lt-Lck)/(1-Lck)式中：Lt-处理叶片的相对电导度；Lck-对照叶片的相对电导度。1.2.5丙二醛(MDA)含量的测定取植物叶片不同叶位的叶片3-5片，洗净擦干，剪成0.5cm长的小段，混均。各称取剪碎的葡萄砧木叶片0.3g，放入冰浴的研钵中，加入少许石英砂和5ml5%三氯乙酸（TCA）溶液（分2次加入），研磨成匀浆，重复三次，并转移到离心管中于3000r离心15min，然后吸取上清液2ml，加入5ml0.5%硫代巴比妥酸(TBA)溶液，摇均，将试管放入沸水浴中煮沸10min（自试管内溶液出现小气泡开始计时），到时间后立即将试管取出并放入冷水浴中。待试管冷却后，3000r离心15min，上清液用于吸光值测定，以0.5%TBA溶液为空白对照，分别测532nm、600nm和450nm处的消光值。MDA(mmol.gFW-1)=[6.452*(D532-D600)-0.559*D450]*Vt/FW*Vs式中：Vt-提取液总体积(ml)；Vs-测定用提取液体积(ml)；FW-样品鲜重。1.2.6叶绿素含量的测定称取剪碎的新鲜叶片（去掉中脉）0.2g，每个葡萄砧木三份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2-3ml96%乙醇研成匀浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白，静置3-5min。过滤到25ml棕色容量瓶中，用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中，直至滤纸和残渣无绿色为止，最后用乙醇定容到25ml。把叶绿体色素提取液倒入比色皿中，以96%乙醇为空白对照，在波长665nm和649nm下测定光密度。Ca=13.95D665-6.88D649；Cb=24.96D649-7.32D665；C=Ca+Cb叶绿体色素含量(mg.gFW-1)=(C*Vt*A)/FW式中：Vt-提取液总体积(ml)；A-稀释倍数；FW-样品鲜重。2结果与分析2.1水分胁迫对葡萄脯氨酸含量的影响水分胁迫10d后，测定葡萄叶片中脯氨酸含量结果见图一。图一水分胁迫对葡萄脯氨酸含量的影响图一表明,在水分胁迫条件下,葡萄叶片中脯氨酸含量增加,并且随着胁迫程度的增加，三个砧木呈现出相同的持续上升趋势。在整个胁迫过程中,贝达叶片脯氨酸含量比对照平均增加了73.33%，变叶葡萄增加了72.59%，5BB增加了81.50%，从而说明变叶葡萄对水分胁迫的抵抗能力较强，5BB对水分胁迫的抵抗能力较弱。2.2水分胁迫对葡萄质膜透性的影响干旱胁迫下细胞质膜透性的变化也是判断品种耐旱性的重要生理标准之一。三个葡萄砧木不同水分胁迫10d后，测定的葡萄叶片细胞质膜透性结果见表二。表二水分胁迫对葡萄叶片质膜透性的影响处理砧木SRWC平均增加（%）CK70%50%30%5BB0.2640.3590.4650.52169.82aA贝达0.2410.3220.4180.46366.39aA变叶葡萄0.2330.2660.3510.43450.36bB注：表中质膜透性是三次重复的平均值从表二看出，经控水干旱胁迫处理，三个葡萄砧木植株叶片的质膜透性都比对照有了较大增加，并且随着土壤干旱程度的增加，叶片的质膜透性也随着升高，但不同砧木在相同干旱条件下叶片质膜透性增加的幅度也不同。如田间持水量为70%、50%、30%的干旱胁迫下，5BB叶片质膜透性比对照分别增加了35.98%、40.15%、97.35%；贝达增加了33.61%、39.83%、92.12%；变叶葡萄只增加了14.16%、36.48%、86.27%；。在同样水分胁迫下，细胞失水越重，质膜透性越大、说明品种的耐旱性越差。在田间持水量为70%轻度胁迫下，细胞质膜透性增加很少，也再次说明变叶葡萄对干旱具有较宽的生态适应性。方差分析变叶葡萄与贝达、5BB叶片质膜透性差异均达到极显著。而5BB与贝达之间不显著。2.3水分胁迫对葡萄叶片丙二醛含量的影响水分胁迫10d后，测定葡萄叶片丙二醛的含量，结果见图二。图二水分胁迫对葡萄叶片丙二醛含量的影响由图二可以看出,在正常灌水条件下,随着植株的生长三种葡萄叶片中的丙二醛含量均缓慢的升高,说明植株在衰老过程中膜脂过氧化作用的加强导致丙二醛含量不断增加。水分胁迫使三种葡萄的丙二醛含量增加,并且随着胁迫程度的增加持续上升,丙二醛的含量也随之增加。在整个胁迫过程中,贝达叶片丙二醛含量比对照平均增加了52.07%，变叶葡萄增加了37.02%，5BB增加了45.85%，从而得出变叶葡萄对水分胁迫的抵抗能力较强。2.4水分胁迫对葡萄叶片叶绿素含量的影响水分胁迫10d后，测定葡萄叶片叶绿素的含量，结果见图三。图三水分胁迫对葡萄叶片叶绿素含量的影响由图三看出，水分胁迫下，供试葡萄叶片叶绿素含量全部下降。同一砧木在不同干旱程度下普遍表现为：土壤水分胁迫越严重，叶片中的叶绿素含量下降幅度越大。变叶葡萄的下降幅度较小，从而说明变叶葡萄比贝达和5BB更抗旱。3讨论3.1植物在水分胁迫条件下有脯氨酸的累积,积累的脯氨酸有利于维持细胞渗透势,防止水分过度流失,为抗氧化物质的合成创造良好的生理环境,并证明脯氨酸是植物对水分胁迫的一种适应[15-17]。在柑橘[15]、葡萄[16]、杏、桃、梅[17]等果树上的试验结果认为,在水分胁迫条件下,果树体内都积累大量脯氨酸,而且抗旱力强的果树种类比抗旱性弱的积累增加的幅度大。实验结果表明,水分胁迫条件下葡萄叶片中有脯氨酸的积累,随着胁迫时间的延长持续增加,在整个水分胁迫过程中,变叶葡萄相对于对照的增长幅度明显低于于其它两个砧木,且葡萄受旱愈严重,脯氨酸累积愈多。因此,葡萄叶片内脯氨酸含量在一定程度上能够反映植物体内的水分情况,可以作为葡萄抗旱性的生理指标。3.2在水分胁迫下，随着干旱程度的加剧，葡萄的质膜透性增加。质膜透性增加可能是由于干旱伤害叶片质膜,并使质膜受到损伤,质膜受损的程度越大，其相对电导率越大、质膜透性也越大[18]。试验结果表明：三个砧木中变野葡萄质膜透性增加最小，其抗旱性比贝达和5BB较强，这同在生产中田间观测结果相一致。上述结果表明：质膜透性受损是植物旱害的敏感指标[19]之一。3.3丙二醛是植物细胞膜不饱和脂肪酸发生过氧化作用的中间产物,丙二醛含量变化是反映细胞膜脂过氧化作用强弱的一个重要指标,其含量高低可以作为细胞膜质损伤程度的参数,是衡量植物在逆境中膜脂过氧化程度的重要指标之一。实