制药工艺学

合成生物制药工艺知识点基础知识1.工程生物：通过基因工程、转基因、合成生物学等工程技术创造的生物。例如重组微生物、合成微生物、转基因植物、转基因动物、采用合成生物学思路，以大肠杆菌为底盘，分析表达重组人干扰素工程菌的构建过程。2.合成生物学：按照人类的目的设计并创造新的生命元件器件，功能模块乃至自然界不存在的生命系统;对现有的生命体进行有意义的工程改造，赋予其新的功能。合成生物学研究如何设计和构建人工生命，依靠人工开发的基因密码，按照预定的方式运行生命。3.生物元器件·基因（生物）元件：具有某种特定的生物学功能的DNA，是设计和合成生物的基本单位。特性：信号接受和输入功能，信号发送和产物输出功能，调节信息流、代谢和生物合成的功能，和其他元件相互作用，具有特定的工作环境。·功能元件：编码1个/组生化反应酶功能基因/基因簇；编码组成细胞组分蛋白质的基因·界面调控元件:包括功能基因转录、蛋白质翻译与修饰、功能酶反应等的调控基因。·生物部件：由一个或多个基因元件组成最简单的能行使催化功能的生物部件是完整的编码酶基因表达盒。·生物模块是一组细胞内区域化的生物部件，由内在功能联系在一起，执行特定的复杂功能。如代谢途径、信号转导途径、调控途径等。模块：通过某种（逻辑/功能）关系把生物元件连接而成。·与电子科学中的电路类似，在合成生物学，不同功能的生物砖联接后，能像电路一样运行，形象地称为基因线路（geneticcircuit）。按功能分为:代谢线路,调控线路,信号线路等。4.合成生物的设计与优化EndyD提出了合成生物学设计的工程策略：标准化、解耦联和抽提。标准化：确立基本生物元件的方法、对生物功能的定义和特征描述。解耦联：复杂系统解分成具有独立功能的简单组分。抽提：建立元件和模块的层阶。1、生物元件的设计与优化抽提：一个反应对应一个酶，一个酶对应一个基因。功能模式：基因表达调控的操纵子模型。优化：功能基因密码子、启动子、核糖体结合位点。适合于不同宿主表达的生物元件。2.基因电路的设计与优化生物砖构建基因电路的困难是，把相同功能的不同生物来源的生物砖集成基因电路后，不一定具有功能。优化方法可以是基于数学模拟的理性设计，也可以是生物元件的直接进化。5.合成生物学的研究思路、应用6.DNA体外重组体外重组是把不同来源的DNA分子用特异性酶切割，然后将两者连接成杂合分子。体外重组的两大工具:核酸限制性内切酶和连接酶，如同剪刀和胶水。6.1质粒载体结构：复制起始点、选择标记、多克隆位点；特性：自主复制性：复制起始点以及控制复制频率的调控基因。不相容性：具有相同或相似复制子结构及特征的的质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内。转移性：从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞。选择标记：抗生素抗性基因等。表达功能：能转录、翻译合成外源基因的产物。类型：克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。测序质粒：用于基因测序。整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合。穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在。表达质粒：能表达基因产物。噬菌粒载体：由丝状噬菌体DNA复制起始位点序列与质粒组成的杂合分子。M13噬菌体间隔区克隆到质粒上，形成噬菌粒。特点：象质粒一样，自主复制而稳定遗传。象噬菌体一样，包装成颗粒，分泌胞外。基因在M13载体和质粒载体之间的转移。激活过程：辅助丝状噬菌体感染带有噬菌粒的受体细胞，反式激活噬菌粒上的间隔区位点，启动噬菌粒以丝状噬菌体DNA的复制模式进行复制。分别包装成颗粒并分泌到受体细胞外。黏粒载体，考斯质粒由λDNA的cos区与质粒DNA重组而成，主要用于基因文库的构建。6.2限制性核酸内切酶概念：在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。种类：I类限制性内切酶：识别位点和切点不同，切断部位不定。II类限制性内切酶：严格识别,特异性切割。III类限制性内切酶：特异性切割，识别部位和切点不同。内切酶的识别序列：4、5或6个碱基对，而且具有180°旋转对称的回文结构。有些酶切割后产生平末端,大部分酶切割后产生黏末端，5′或3′突出末端。.影响酶切的因素：活性单位（1U）定义：为50μl反应体系中，特定温度下经过1小时反应，完全分解1μgDNA所需酶量。甲基化：从带有DNA甲基化酶基因的宿主中分离制备DNA，其碱基一部分被甲基化，影响酶识别和切割能力，甚至不能切割。星号活性：限制性酶对底物的特异性降低，导致切割非特异识别位点，电泳弥散（smear）。尽可能降低甘油浓度，在中性pH和高盐离子浓度下进行酶切反应。缓冲液与温度：每种酶都有最适反应缓冲液，应在最佳工作温度下和反应缓冲液中进行。酶量与反应时间：增加酶量，相应缩短时间。质粒纯度不很高，酶切反应通常在数倍过量酶的条件下进行。6.3连接反应与连接酶DNA连接酶催化的基本反应：DNA双链上相邻的3′羟基和5′磷酸基因共价结合形成3′—5′磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来。T4噬菌体的DNA连接酶：以ATP作为辅助因子，它在与酶形成复合物的同时释放出焦磷酸基团。大肠杆菌DNA连接酶：以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）作为辅助因子。活化后的酶复合物结合在DNA的缺口处，修复磷酸二酯键，并释放AMP。T4-DNA连接酶比大肠杆菌连接酶具有更广泛底物适应性。6.4DNA聚合反应与聚合酶DNA聚合酶：催化DNA分子进行体外合成反应，与体内相似，一般需要模板，合成产物为模板的互补序列。根据聚合酶依赖的模板，可分为：依赖于DNA的DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段、T4和T7DNA聚合酶及热稳定性DNA聚合酶；依赖于RNA的DNA聚合酶：反转录酶。不依赖于模板的聚合酶：能把核苷酸加到DNA分子的末端，即末端转移酶。依赖于DNA的RNA聚合酶：活性：5′→3′聚合活性、3′→5′外切活性、5′→3′外切活性用途：大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段Klenow酶用途：1）3’凹端补平，使之成为平末端；2）对DNA片段进行标记，合成探针；3）用于催化cDNA第二链的合成；4）用于双脱氧末端终止法测定DNA的序列。T4-DNA聚合酶：修平非平头的cDNA分子以及由某些限制性核酸内切酶水解产生的3’突出末端。末端转移酶：转移活性比其他聚合酶高，用于RT和PCR反应物、载体末端加同聚物和3末端标记反应。多核苷酸聚合酶：用于RNA3标记和加poly(A)。RNA聚合酶：可用于合成RNA探针、体外翻译，可用T7转录系统在大肠杆菌、酵母中表达外源基因。碱性磷酸酶来源于大肠杆菌和牛小肠。细菌碱性磷酸单酯酶和牛小肠碱性磷酸单酯酶（CIAP）均能催化DNA、RNA核苷酸的5′端单酯水解，除去磷酸，需要辅基Zn2＋，但不能催化磷酸二酯和三酯的水解。在DNA重组实验中，该酶用于载体DNA的5′末端除磷操作，以提高重组效率。外源DNA片段的5′端除磷磷酸基，则可有效防止外源DNA片段之间的连接，提高重组效率。在核酸5′末端标记前，用碱性磷酸酶除去磷酸，可得到较高的标记效率。基因工程菌的构建：基因元件的设计与表征、DNA组装、遗传转化与筛选鉴定一、基因元件的设计与表征1.RNA聚合酶的设计与表征1.1T7RNA聚合酶的正交转录设计使用其他生物的转录装置和转录因子调控，是实现正交基因转录设计的一个重要策略。T7RNA聚合酶是可用的正交元件，它只识别结合自身的T7启动子，不识别宿主的启动子，可以解决与天然宿主体系中RNA聚合酶的冲突，自成系统，这样能减少异源基因的表达对宿主细胞的负载。T7RNA聚合酶已经在大肠杆菌等革兰氏阴性菌、链霉菌等革兰氏阳性菌、植物叶绿体和动物细胞中得到了应用。T7RNA聚合酶的突变改造：采用随机突变、定点突变、组合突变等策略，获得活性和热稳定性不同（不同温度下的不同活性）的T7RNA聚合酶。例如，K172G取代，显著降低了合成速率，但与启动子的结合率未变化。K172L取代和KR（172-173位）缺失对催化活性没有影响，但结合活性下降，并且对无T7启动子的基因表现出转录活性。T7聚合酶与启动子的正交筛选：突变T7聚合酶，改变对启动子的特异性和转录强度。突变启动子序列：可获得转录强度不同的启动子。突变聚合酶与及其对应启动子序列的组合，可实现正交转录。最近，采用噬菌体辅助循环进化策略，以启动子序列为靶点，经过反复循环进化，筛选T7RNA聚合酶突变体，满足合成生物学研究中基因转录的正交设计。这种筛选策略，也改变了T7RNA聚合酶的优先转录起始碱基，实现RNA聚合酶突变与启动子突变的协同进化。已经开发了多种具有正交转录的T7RNA聚合酶及其对应的启动子，使用多信号调控（如多种诱导剂），实现对不同的细胞过程和代谢途径的精细控制。T7聚合酶的分段表达：使用全长T7RNA聚合酶，有些异源基因表达系统不稳定。例如，用阿拉伯糖诱导全长RNA聚合酶表达中，目标基因表达量下降。把T7RNA聚合酶分解成两部分，即N端结构和C端结构分段进行表达。该表达系统对诱导剂浓度有较高的适应性，比全长酶稳定。目前对T7RNA聚合酶分段表达及其突变研究中，都表现出减活突变，即转录活性都低于野生型酶。T7RNA聚合酶催化异源单顺反子基因的长度达10kb以上，在多顺反子串联基因表达中，离启动子越远，基因转录强度越低。T7RNA聚合酶的合理使用-质粒表达：高拷贝载体表达的优点：在短时间内转录翻译形成大量的聚合酶，用于目标基因的转录。缺点是，T7RNA聚合酶表达超过了宿主RNA聚合酶，将严重干扰大肠杆菌RNA聚合酶的功能，表现出较强的细胞毒性，引起细胞死亡、异源基因表达减产。发酵过程不稳定，过重的代谢负载，缩短了生产周期。一般采用低拷贝载体，用阿拉伯糖或IPTG诱导的启动子控制。如果T7RNA聚合酶表达的毒性仍然较强，可采用弱的RBS、使用GTG起始密码子、N端连接Lon介导的标签等还可对RNA聚合酶进行减活突变，如R632S，尽可能保留转录活性，降低细胞毒性。T7RNA聚合酶的合理使用-染色体表达：虽然T7RNA聚合酶与T7启动子序列之间具有很高的特异性和严紧性，但仍然存在基础表达（本底渗漏表达）。有时候，T7RNA聚合酶的渗漏表达也能引起异源蛋白质的大量表达，致使表达系统不稳定。具体表现为表达载体转化子的前几代能检测到目标产物，以后随着保存和传代增加，丧失了工程菌的表达特征，但对生长和活性没有影响。因此，T7RNA聚合酶的表达应该是严紧诱导调控的，避免与宿主RNA聚合酶之间发生冲突。通常T7RNA聚合酶是以DE3形式整合在大肠杆菌的染色上（如E.coliBL21(DE3)），由lacUV5诱导启动子控制，受到染色体LacI的阻遏。在生长阶段中，T7RNA聚合酶不表达。当达到一定生物量时，诱导表达T7RNA聚合酶，同时解除目标基因的阻遏，生成目标产物。如果质粒中没有lacI，仅染色体上单拷贝lacI往往不足以抑制基础表达。应该在质粒上增加lacI基因。双阻遏策略调控T7/lacO启动子，减少基础表达和外源蛋白的毒性。使用溶菌酶表达载体，如pLysS或pLysE，可进一步降低T7RNA聚合酶的本底渗漏表达。使用rhamnose诱导T7RNA聚合酶表达，recA突变体的大肠杆菌（如BLR(DE3)，严紧控制T7RNA聚合酶的基础表达，有利于异源基因的稳定高效表达。1.2全局转录装置工程美国MIT的StephanopoulosG等提出了全局转录装置工程（Globaltranscriptionmachineryengineering，gTME)策略，对RNA聚合酶及其转录因子进行改造，从而改变细胞的基因型和表型。转录因子的突变将引起其他大量受调控基因的转录图谱变化，从而达到全局调控的效果。在酵母（提高乙醇耐受性和产量）和大肠杆菌中都获得成功。大肠杆菌RNA聚合酶的设计改造：采用易错PCR（error-pronePCR），构建了大肠杆菌的rpoA(α亚基)和ropD（σ70）突变文库。α-CTD结构域的V257F和L281P、V257R、L254Q等突变体，以及σ70截短性突变体。E244突变为终止子，得到缺失α-CTD的截短α亚基，也能进行转录