功能化导电高分子纳米网络从控制氧化聚合到细胞工程

功能化导电高分子纳米网络从控制氧化聚合到细胞工程Shyh-ChyangLuo,BoZhu,AikoNakao,ReikoNakatomiandHsiao-huaYu摘要：在这项工作中我们提出了批量合成各种功能导电高分子纳米网络的一种一般方法。3,4-乙撑二氧噻吩（EDOT）二聚体用于启动官能化EDOT在具有高极性溶剂体系中的化学聚合，这将更好地控制氧化聚合。在这些反应条件下，各种官能化EDOT单体形成聚合纳米网络结构。我们还评估了在这些导电聚合物纳米网络中细胞的生长和细胞的存活率。纳米网络为PC12细胞提供高度生物相容的材料并且它们显示出在表面上的良好附着。功能化导电聚合物纳米网络的这些特性预示着一个有前景细胞工程的平台。导电聚合物纳米结构主要因为它们在电子和生物科学领域的潜在应用最近吸引了关注。[1]一些研究已表明通过导电聚合物纳米线组装的电子设备对比那些通过本体导电聚合物的在如灵敏度和效率上表现出优越的性能。[2]一般构造导电聚合物纳米结构最常用的方法是利用阳极氧化铝作为硬多孔模板进行导电聚合物的直接电聚合，[3]或应用表面活性剂作为软模板进行化学聚合。[4]近来，多种无需使用模板的一维导电聚合物纳米结构的合成方法已经开发了出来。[1b]在所有导电聚合物中，聚3,4-乙烯二氧噻吩（PEDOT）[5]由于其在含水环境下优越的稳定性和生物相容性使我们感兴趣。[6]这些特性激起几个小组应用PEDOT于生物医学应用上。[1d,6,7]目前，具有包括羟基，[8]羧酸[9]和叠氮基团[10]等各种官能团的用于生物缀合的目的EDOT单体也已经有了报道。因此，一般的合成方法来装配这些官能化PEDOT纳米结构于各种生物应用，如组织工程和生物电子学是十分重要的。几项最近研究证明导电聚合物的二聚和低聚物类充当种可促进一维导电聚合物纳米结构的形成。[11]该方法提供了对于聚苯胺（PAni），聚吡咯（PPy）和聚噻吩（PT）纳米纤维无模板和大规模的合成。[11a]然而，（PEDOT）纳米结构至今尚未报道的研究很少为类似的方法，以1-D官能化的聚（3,4-亚乙二氧基）。不像吡咯、苯胺和噻吩，噻吩环的3,4位的亚乙二桥的位阻会阻止孤立的一维纳米纤维的形成。此外，官能团对纳米结构的形成的影响甚至更难预测。我们在此论证，经仔细调节聚合条件，通过在如方案1所示的化学聚合步骤中使用EDOT二聚体作为引发剂来创造官能化PEDOT纳米网络是可行。我们使用PC12细胞线来评估这些纳米网络的生物相容性并测试这些纳米网络相比平板官能化PEDOT薄膜的细胞生长。方案.1.EDOT二聚体用于诱导PEDOT纳米网络的形成和官能化PEDOT。PEDOT纳米网络涂覆用于细胞接种的底物。和以前一维PT纳米结构的合成工作不同，[11a]EDOT和官能化EDOT由于它们相比噻吩相对低的氧化电位在加入三氯化铁作为氧化剂后在诸如氯仿、氯苯、甲苯和乙腈的有机溶剂中化学聚合迅速。溶液在添加氯化铁后立即呈深蓝色，这表明官能化EDOTs的聚合。然后我们检查了这些溶液中加入EDOT二聚体的影响。不幸的是，EDOT二聚体的加入未促进PEDOT一维纳米结构在这些溶液中的形成。溶液和聚合物结构的图像示于辅助信息图S1和S2。多次尝试后，我们意识到化学聚合速率与反应进行的溶剂强烈相关。比如，单体在甲醇/乙腈的组合溶剂系统中聚合非常缓慢。单体溶液即使在初始加入氯化铁的24小时后未显示深蓝色。在仅加入EDOT二聚体后，溶液在几个小时内变为暗蓝色。该现象表明EDOT二聚体在这种反应条件下充当活性种引发的化学聚合。我们通过使用SEM检测了聚（EDOT）、聚（EDOT-OH）、聚（EDOTCOOH）和聚（EDOT-N3）的纳米结构如图1所示。不同于辅助信息图S2中所示的制备自有机溶剂的聚（EDOT），制备自二聚体诱导聚合的聚合物表现出清晰的纳米网络结构。在这些纳米网络，细长的纳米纤维被观察到长度介于200到350nm以及对这些纳米网络而言纳米纤维的直径主要是在20到40nm的范围内。我们还研究了如辅助信息图S3中所示的二聚体浓度对纳米结构的影响。伴随二聚体浓度的增加，纳米网络倾向于向彼此塌陷并且在纳米网络中的尺寸减小。基于这些实验结果，我们得出结论：聚合速率的控制是形成一维官能化PEDOT纳米结构的关键以及速率由溶剂环境和EDOT二聚体活性种的存在控制。图.1.(a)聚EDOT、(b)聚（EDOT-OH）、(c)聚（EDOT-COOH）和(d)聚（EDOT-N3）纳米网络的SEM图像。官能团的识别还通过了如图2的X射线光电子能谱（XPS）进行。相比聚EDOT的C1s峰，聚（EDOT-OH）和聚（EDOT-COOH）纳米网络的C1s峰由于官能团上C-O和C=O键的存在显示出更高的比率在285到288eV间的高结合能。聚（COOH）的C1s显示在288eV的强峰是因为如图2（c）中所示的主要来自于C=O双键的缺电子碳。在如图2（d）所示的聚（EDOT-N3）XPS光谱，观察到在400.4和403.9eV的两个N1s峰。在400.4eV的峰是由于富电子外氮的叠氮基团以及在403.9eV的峰是由于缺电子内氮。这结果也表明聚（EDOT-N3）纳米网络上存在叠氮官能团。图3示出在细胞接种96小时后PC12细胞在聚合物平坦表面及纳米网络上细胞活力的图像。结果显示在平坦表面和纳米网络上PC12细胞都具有高细胞活力，表明细胞活力不受表面形貌的影响。此外，这三种官能团并未引起对细胞活力明显影响。所有平坦表面和纳米网络提供了生物相容性良好的细胞培养平台。如图4所示我们通过使用扫描电镜进一步评估了两种基片上的细胞形态和细胞附着。在聚（EDOT-OH）平膜和纳米网络PC12细胞表现出很好的附着以及长丝也很好地延长。从图3中所示的图像，比较平坦薄膜和纳米网络细胞增殖率和细胞形态看上去稍有不同。但SEM图像没有提供它们之间的重大差异。需要进一步的研究以确认形态对细胞行为的影响。图.2.（a）聚EDOT的C1s峰、（b）聚（EDOT-OH）的C1s峰、（c）聚（EDOT-COOH）的C1s峰，以及（d）聚（EDOT-N3）纳米网络示于C1s峰的N1s峰峰拟合（虚线）和基线拟合（虚线）的XPS谱。总之，我们已经成功地开发了通过溶剂体系和氧化剂控制聚合速率本体聚合官能化的PEDOT纳米网络的一般方法。当反应速率降低时，期望的纳米结构在作为活性种和催化剂的EDOT二聚体的存在下形成。纳米网络为PC12细胞提供高度生物相容性的平台并且细胞在表面上显示出良好的附着。纳米形貌对细胞行为的影响目前正在进行研究而官能化PEDOT纳米网络的这些特点对细胞工程而言是充满前景的。试验材料EDOT（Sigma-Aldrich公司），过硫酸铵（APS，Wako公司），和盐酸（HCl，Wako公司）以分析纯使用未经进一步纯化。EDOT二聚体[12]、EDOT-OH[8]、EDOTCOOH[9]以以下作为参考相同的步骤合成。对于EDOT-N3的合成，我们遵循相同的参考步骤[10a]以及一些修改。取代使用氯官能化EDOT作为起始原料，我们使用的EDOT-OH作为起始原料。EDOT-OH（2.44g，14.0mmol）通过加入甲基磺酰氯（1.4mL，18.0mmol）在干燥二氯甲烷（30mL）和三乙胺（2.7mL）中活化形成甲磺酰基官能化EDOT用于与NaN3的反应。PEDOT膜通过使用如前述的电聚合制备[10c]。一维纳米结构合成于溶解了官能化EDOT单体的甲醇（25mM，1mL）溶液，其混合了溶解三氯化铁的乙腈溶液（25mM，1mL）和HCl（100mM）。注射EDOT二聚体氯仿溶液(50×103M，20μL)后，将混合溶液剧烈振荡10秒再静置3小时。产物通过加入甲醇（2mL）后4000rpm离心10分钟进行洗涤。洗涤步骤重复三次。在此之后，产品分散在甲醇中进行进一步表征。表征单体和聚合物被分散在甲醇来进行测量。SEM通过一个FE-SEM（JSM-6330F，JEOL）进行。试样在金原子涂覆的玻璃上通过下拉式铸造制备。XPS是由一个ESCALAB250（热VG）系统进行。试样在金原子涂覆的玻璃基板上通过下拉式铸造制备。细胞培养的PC12细胞购买自Riken细胞库。Dulbecco氏改良Eagle培养基和胎牛血清购自Invitrogen公司。基板放置在12孔板中，并且装载1mL细胞悬浮液（105个细胞·mL-1）。细胞培养在配有10％胎牛血清和5％马血清的DMEM培养基中，并保持在37℃5％CO2/95％空气的潮湿气氛中。细胞存活率检测采用台盼蓝排斥试验。图.3.PC12细胞接种96小时后的图像和细胞细胞活力，培养在聚EDOT、聚（EDOT-OH）、聚（EDOT-COOH）和聚（EDOT-N3）的光滑薄膜和纳米网络中。图.4.PC12细胞接种96小时后，其培养在（a）光滑聚EDOT-OH和（b）聚（EDOT-OH）纳米网络上的SEM图像。用于SEM分析的PC12细胞制备固定在4％的戊二醛的溶液在1×PBS下2小时，洗涤/漂洗，并在1％四氧化锇的0.1MPB溶液中再次固定。然后将样品在逐渐增加乙醇浓度的水中脱水（50％乙醇10分钟;70％乙醇10分钟;85％乙醇10分钟;90％乙醇10分钟;95％乙醇20分钟;在100％乙醇20分钟），在临界点干燥器中干燥，溅射涂覆几纳米的金。