双水相萃取的应用课件

双水相萃取的应用twoaqueousphaseextraction主讲人：宋孟娇组员：于宝云刘红高健云李洋王立华刘永花孙越陈美静李志鹏前言萃取：利用物质在两种互不混溶的溶剂中的分配差异进行分离的技术。有机溶剂萃取：以与水互不相溶的有机溶剂作萃取剂从水相中萃取目的产物，广泛应用于抗生素、有机酸、维生素等发酵产品生产。用于蛋白质、核酸、酶等生物大分子的分离很少成功。反萃取：使用水溶液从有机溶剂中萃取水溶性的物质。反胶团萃取：超临界萃取：双水相萃取双水相系统：因两种水溶性聚合物水溶液或一种水溶性聚合物的水溶液与盐溶液混合时的不相容性而形成有明显界面的两相系统。特点：因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两相中水分都占很大比例(85％~95％)，活性蛋白或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同比例分配于两相，这就克服了有机溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂的缺点。发展历史1896年荷兰微生物学家Berjerinck发现琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合时形成双水相现象。1956年瑞典lund大学的Albertsson教授及其同事开始对双水相系统进行比较系统研究。测定了许多双水相系统的相图，考察了蛋白质、核酸、病毒、细胞及细胞颗粒在双水相中的分配行为，为双水相萃取系统的发展奠定了基础。只局限于实验室内的测定和理论研究。发展历史Kula教授研究小组对双水相的应用、工艺流程、操作参数、工程设备、成本分析等进行了大量研究，在应用上获得成功。1978年首先将双水相萃取技术用于酶的大规模分离纯化，建成了一套工业装置，达到20kg/h的处理能力，分离纯化了几十种酶，也应用于基因工程产品的分离。双水相萃取可分离多肽、蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器、细胞组织，以及重金属离子等，近年来，还应用于一些小分子，如抗生素、氨基酸和植物的有效成分等的分离纯化。作为反应系统用于酶反应，生物转化，发酵的产物生产与分离的集成。萃取原理双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同时,物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种作用力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。物质在双水相体系中分配系数K可用下式表示：K=C2/C1其中K为分配系数，C2和C1分别为被分离物质在上、下相的浓度。生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用等。因此，分配系数是各种相互作用的和:lnm=lnme+lnmh+lnmlme，mh，ml分别为静电作用、疏水作用和生物亲和作用对溶质分配系数的贡献。分配系数K等于物质在两相的浓度比,由于各种物质的K值不同,可利用双水相萃取体系对物质进行分离。其分配情况服从分配定律，即，“在一定温度一定压强下，如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里，达到平衡后，该物质在两相中浓度比等于常数”，分离效果由分配系数来表征。可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙醇(PEG)/葡聚糖(Dx)，聚丙二醇/聚乙二醇和甲基纤维素/葡聚糖等。双水相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，例如，PEG/磷酸钾(KPi)、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG，下相富含无机盐。双水相体系各种类型的双水相体系类型形成上相的聚合物形成下相的聚合物非离子型聚合物/非离子型聚合物聚乙二醇葡聚糖聚乙烯醇聚丙二醇聚乙二醇聚乙烯吡咯烷酮高分子电解质/非离子型聚合物羧甲基纤维素钠聚乙二醇高分子电解质/高分子电解质葡聚糖硫酸钠羧甲基纤维素钠聚合物/低分子量化合物葡聚糖丙醇聚合物/无机盐聚乙二醇磷酸钾硫酸铵常用的双水相体系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dx)体系和PEG/磷酸盐体系。PEG/Dx体系一般用于小规模地分离生物大分子、膜、细胞等，PEG/无机盐体系主要用来大规模地提纯酶，这是因为PEG/无机盐体系的萃取专一性更高，葡聚糖价格昂贵的缘故。物质在两相中的选择性分配是疏水键、氢键和离子键等相互作用的结果，可溶性物质的分配情况可由分配系数K来表征，细胞这些更大颗粒的分配情况则由分配比P来表征。影响蛋白质及细胞碎片在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH值、温度等。双水相萃取的基本特点(1)体系有生物亲和性。两相中的水分含量通常高达85%～95%，所用的聚乙二醇PEG、葡聚糖dextran等高聚物或磷酸盐、硫酸盐等无机盐对蛋白质、核酸等生物活性物质无毒害，甚至还有稳定保护作用，而且相界面张力比水-有机或有机-有机两相体系的界面张力要小1～3个数量级。由于生物活性物质在有机溶剂中易变性，再加上有的生物活性物质亲水性很强，不溶于有机溶剂，有机溶剂萃取等分离技术难以在生物活性物质的分离中发挥其效能。(2)与常用的亲和层析相比，双水相萃取能够在较少的溶液量和较短的操作时间内获得较高产量的产品。另外，操作能够容易、精确地按比例放大，非常适合大规模应用，可进行连续生产。而亲和层析由于操作难于放大，应用受到限制。(3)聚合物的浓度和分子质量、无机盐的种类和浓度、pH以及温度等均能影响被分配物质在两相间的分配，所以操作容易进行控制，进而达到目的产物的最佳萃取条件。(4)可与细胞破碎相结合，即细胞悬浮液中加入PEG和无机盐后再通入珠磨机进行破碎，然后用离心机分相。既节省了萃取设备和时间，又避免了胞内酶的损失。(5)能进行萃取性的生物转化。在一些双水相体系中可将发酵生产过程中的生物转化与下游处理的第1步相结合，即生物反应在其中一相中进行，同时生成的反应产物被连续萃取到另一相中。不仅解决了产物反馈抑制作用造成的产量低的问题，而且酶在高聚物溶液中比在缓冲液中更稳定，活性更大。因为生物反应和生物产物的提取同时进行，尤其适于连续生产。(6)亲和萃取(亲和分配)可大大提高分配系数和萃取专一性。由于目标蛋白质与其他杂蛋白的理化性质相近，造成其萃取专一性不高。亲和萃取就是将一种和目标蛋白质有很强亲和力的配基与一种成相聚合物共价结合，该成相聚合物与另一种成相聚合物形成双水相体系进行萃取时，目标蛋白质专一性地进入结合有配基的那种成相聚合物所在相中，其它杂蛋白则进入另一相。此技术已用于乙醇脱氢酶、丙酮酸激酶和核酸内切酶等酶以及细胞、细胞器、膜等粒子的提取。双水相萃取的优点操作条件温和，在常温常压下进行。两相的界面张力小，一般在10-4N/cm量级，两相易分散。两相的相比随操作条件而变化。上下两相密度差小，一般在10g/L。因此两相分离较困难，目前这方面研究较多。易于连续操作，处理量大，适合工业应用。缺点和不足双水相系统含较高浓度的水溶性聚合物和盐，会带到产物中，去除需要辅助处理方法。成本较高。即使水溶性聚合物和盐尽管回收再用。选择性较低，分离纯化倍数低，一般只适用于粗分离。四、双水相萃取技术在生物、食品工业中的应用双水相萃取在生物和食品工业等领域的研究和应用发展较快。到目前为止，双水相萃取应用及研究主要集中在以下几个方面：(1)提取酶和蛋白质。这是双水相体系研究和应用最多的方面，发酵液、细胞培养液、植物、动物组织中细胞内、外的酶和蛋白质均可用双水相体系来提取。工业上已有几种双水相体系用于从发酵液中分离提取蛋白质和酶，绝大多数是用PEG作上相成相聚合物，葡聚糖、盐溶液和羟甲基淀粉的其中一种作下相成相物质。(2)进行萃取性生物转化。应用实例有：利用葡萄糖和淀粉生产乙醇、利用葡萄糖生产丙酮丁醇、利用淀粉和纤维素水解生产葡萄糖、水解酪蛋白、发酵生产乳酸、将青霉素G转化为6-氨基青霉烷酸等。(3)食品工业中用来从酸水解产物中提取二肽、氨基酸、核苷酸等风味物质。在生物技术方面，可用来提取DNA。(4)萃取细胞、细胞器、膜等粒子。大多数都是用亲和萃取方法来达到目的的。(5)应用于液-液分配层析(LLPC)。将一种聚合物连接在固体颗粒(支持物)上，另一种聚合物的溶液作为流动相，这种柱层析技术可分离蛋白质、核酸以及细胞混合物。(6)中草药中有效成分的提取：近年来有关双水相提取天然药物中有效成分的报道逐年增多。以乙醇-磷酸氮二钾-水双水相体系萃取甘草有效成分，在最佳条件下，分配系数(K)达12.8，收率(Y)高达98.3%。用双水相萃取体系富集分离银杏叶浸取液的研究，也有良好的分配系数和分离效果。(7)双水相在金属离子分离中的应用：传统的金属离子溶剂萃取方法存在着溶剂污染环境、对人体有害、运行成本高、工艺复杂等缺点。近年来，利用双水相技术萃取分离金属离子达到了较高的水平。新型双水相系统的开发：在生物物质分离过程中得到应用的双水相系统有2类：非离子型聚合物/非离子型聚合物/水系统和非离子型聚合物/无机盐/水系统。因为这2类系统所用的聚合物无毒性,己被许多国家的药典所收录,而且其多元醇、多元糖结构能使生物大分子稳定。但在实际应用中,这2类双水相系统各有优缺点,前者体系对生物活性物质变性作用低,界面吸附少,但是所用的聚合物如葡聚糖价格较高,而且体系黏度大,影响工业规模应用的进展；后者成本相对低,黏度小,但是由于高浓度的盐废水不能直接排入生物氧化池,使其可行性受到环保限制,且有些盐对敏感的生物物质会在这类体系中失活。因此,寻求新型双水相体系成为双水相萃取技术的主要发展方向之一,新型双水相体系的开发主要有类廉价的双水相系统及新型功能双水相系统。五、双水相萃取技术进展及展望廉价双水相系统的开发目前主要集中在寻找一些廉价的高聚物取代现用昂贵的高聚物,如采用变性淀粉、麦芽糊精、阿拉伯树胶等取代葡聚糖,羟基纤维素取代PEG等。对新型双水相系统的探索有：PEG/UCON(乙烯基氧与丙烯基氧共聚物的商品名）/水体系、UCON/水体系、EOPO[环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的随机共聚物简称EOPO]/羟基淀粉/水体系和EOPO/水体系等。这些体系分相的依据仍是聚合物之间的不相溶性,但此性质与特定的临界温度有关。此类双水相系统也被称作热分离型双水相系统,它们的优点之一是聚合物易于回收可实现循环利用。双水相萃取是一项可以利用不复杂的设备，并在温和条件下进行简单的操作就可获得较高收率和纯度的有效成分的新型分离技术。目前利用双水相萃取技术从食品及发酵工业生物材料中提取有效成分的研究已经引起了人们的重视。由于这些生物材料中所含的化合物众多，而双水相萃取技术具有较高的选择性和专一性，因此，利用这项技术有希望为从食品及发酵工业生物材料中提取有效成分开辟了一条崭新的思路。双水相萃取技术工业应用上的问题但是,双水相萃取技术目前仍不是十分成熟,理论及技术均存在一定的问题。尽管双水相体系的分配机制已成为研究重点,但并未彻底清楚;体系的物理、化学性质还未完全了解,导致难以达到最佳萃取条件,因而应用有限。成相聚合物价格昂贵是阻碍该技术应用于工业生产的主要因素。葡聚糖是医疗上的血浆代用品，价格很高，用粗品代替精制品又会造成葡聚糖相粘度太高，使分离困难。研究应用最多的PEG并不是双水相体系最适和的聚合物，磷酸盐又会带来环境问题，故开发新的聚合物是该技术应用急需解决的问题。dextran可被改性淀粉(reppalPES)、糊精、麦芽糖糊精、乙基羟乙基纤维素(E-HEC)等代替。聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)已作为PEG的替代品。磷酸盐已被硫酸钠、硫酸镁、碳酸钾等盐取代。