双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价

1双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价摘要：目的评价双缩脲法测定血清总蛋白的方法性能。方法配制双缩脲试剂，并用所配双缩脲试剂和标准血清蛋白进行批内重复性试验、回收试验、线性范围测定。结果双缩脲法测定血清总蛋白的批内重复性试验的变异系数CV%为6.42，回收试验平均回收率为109.3%，线性范围测定的R²为0.9877。结论双缩脲法测定血清总蛋白的性能不高，本人测得的批内重复性试验的变异系数CV%偏大，回收率偏高，线性范围一般，或许这是个人操作因数，因为还有其他同学的结果比较好的。关键词：双缩脲法；血清总蛋白；方法学评价双缩脲法测定血清总蛋白至今已经有近100年的历史，其间该方法也得到不断改进，是目前测定血清总蛋白的常用方法之一。《全国临床检验操作规程》推荐Doumas双缩脲配方作为血清总蛋白测定的常规方法[1]。方法学评价对于医学检验专业学生日后在工作中评价检验方法非常重要，对培养学生逻辑思维和实验室质量控制具有重要作用。本文介绍双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价，对学生练习和掌握方法学评价有重要意义。双缩脲试剂鉴定蛋白质的原理：双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此，也能在碱性环境中与二价铜离子结合生成紫红色络合物。此反应不需要加热，被用来定性鉴定蛋白质。但请注意：凡含有2个以上肽键的物质或含有1个肽键和1个一CS—NH2、一CH2一NH2、一CH20H、一CHOHCH2NH2等基团的物质，以及乙二酰乙二胺都有此颜色反应。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽均有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽[2]。2紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。1.仪器与试剂1.1仪器721型分光光度计；水浴箱。1.2试剂牛血清白蛋白；硫酸铜结晶(CuSO4•5H2O)；酒石酸钾钠(NaKC4H4O6•4H2O)；氢氧化钠(NaOH)；碘化钾(KI)；蒸馏水。2.双缩脲的配制2.1称取6gNaOH溶于新鲜制备的25ml蒸馏水中，配成6mol/L氢氧化钠溶液。称取0.75g硫酸铜，2.25g酒石酸钾钠，1.25g碘化钾依次溶解于125ml蒸馏水中．在搅拌下加人6mol/L氢氧化钠溶液25ml，用蒸馏水定容至250ml。配好的双缩脲试剂应贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存，若瓶中有黑色沉淀出现则衙重配。2.2通常加入碘化钾可以防止铜离子自动还原形成一价氧化铜沉淀。在配制双缩脲试剂过程中，进行两种不同加试剂顺序，如下顺序1：硫酸铜→酒石酸钾钠→碘化钾→氢氧化钠顺序2：硫酸铜→碘化钾→酒石酸钾钠→氢氧化钠这两种顺序的区别是加酒石酸钾钠和加碘化钾的顺序不同，“顺序1”在加完酒石酸钾钠后溶液是青蓝色的(如图1左)，“顺序2”在加完碘化钾后溶液颜色是褐色的(如图1右)，但两种顺序在加完所有试剂后，颜色都是相同的，都为深蓝色，如图2。这两种不同加试剂顺序的配制方法，虽然过程不同，过程中颜色变化也不同，但最后的结果是相同的。3图1(左为先加酒石酸钾钠)图2(左为先加酒石酸钾钠)3.批内重复性试验3.1材料待测样品、双缩脲试剂、蒸馏水、721型分光光度计、水浴箱3.2方法3.2.1取21支试管放试管架，分别标记空白管1支，重复测定管20支，按表1添加试剂。表1试剂添加加人物(ml)试剂空白管测定管×20蒸馏水0.06—待测样品—0.06双缩脲试剂333.2.2涡旋混匀后，37℃水浴10分钟，在波长540nm条件下比色，空白管调零，用分光光度计测定各管吸光度。3.2.3计算待测样品的标准差S和变异系数CV%值。3.3结果3.3.1结果记录表220个测定管的吸光度值试管号吸光度试管号吸光度试管号吸光度试管号吸光度10.12160.12110.14160.1420.13170.123120.14170.14430.1480.128130.139180.13940.12990.12140.146190.14250.139100.125150.139200.13943.3.2批内重复性试验结果处理计算公式标准差)1()(2nxxs，变异系数100)(%xsCV标准差s=0.0086，变异系数CV%=6.423.4讨论评价3.4.1批内重复性试验测得数据的CV%=6.42，CV%值比较大，超过4.0，说明测定的精密度比较低。原因可能有以下几点：①实验中使用的分光光度计比较老旧，一直性能不稳定，多位同学使用后都表示结果不太好。②使用的加样枪很多都老化了，不好用，导致封密性不强，实验误差大。③个人加样误差，在一些关键试剂上加样可能有误差。④所使用的比色杯经过多次使用，比色杯壁里遗留一些有色物质，影响了测量结果。3.4.2通过10位同学结果的比较，如表3，有五位同学的结果小于4，另五个同学的结果大于4，最大的CV值是本人测得，说明本人的结果比较差，双缩脲法测定血清总蛋白的精密度不算太好。表310位同学结果的比较均值标准差s变异系数CV%本人0.13420.00866.42同学10.13530.00533.94同学20.12070.00393.24同学30.14030.00483.45同学40.14140.00412.89同学50.14990.00553.66同学60.15420.00855.35同学70.11090.00534.81同学80.14610.00785.33同学90.13080.00665.054.回收试验54.1回收试验原理回收试验是反映分析方法准确测定加入样品中已知浓度或量的纯分析物能力的试验，是评价方法准确度的有效方法。回收试验可有效反映方法的比例系统误差，也可反映方法的竞争性干扰。本实验通过双缩脲法测定蒸馏水中加入的蛋白质的回收率，判断双缩脲法比例系统误差的大小，从而评价方法的准确性。4.2回收样品制备表4基础样品回收样品1回收样品2回收样品3待测样品0.15mL0.15mL0.15mL0.15mL150g/l蛋白—0.05mL0.1mL0.15mL蒸馏水0.15mL0.1mL0.05mL—4.3蛋白质浓度测定4.3.1蛋白质浓度测定的加样，如表5表5试剂(mL)空白管标准管样品管蒸馏水0.06——150g/l蛋白溶液—0.06—样品——0.06双缩脲试剂333注：空白管和样品管各做一管，样品管每个样品做2管取平均值，共计1+1+2+2+2+2=10管。4.3.2涡旋混匀后，37℃水浴10分钟，在波长540nm条件下比色，空白管调零，用分光光度计测定各管吸光度。4.4结果4.4.1结果记录表6蛋白质浓度测定的吸光度值标准管基础管样品管1样品管2样品管3吸光度0.3100.0490.0500.1000.1090.1530.1690.2330.229平均值0.3100.0500.1050.1610.23164.4.2结果计算加入浓度(g/L)=150×(回收样品中加入的150g/L蛋白溶液体积/0.3)回收浓度=回收样品测得能浓度—基础样品测得浓度回收率=(回收浓度/加入浓度)×100%表7样品回收回收样品1回收样品2回收样品3加入浓度(g/L)255075回收浓度(g/L)25.953.787.6回收率1.0361.0741.168平均回收率1.093标准偏差0.068CV%6.2194.4.2回收试验评价一般要求回收率在95%~105%，最为理想的回收率为100%，本实验测得的平均回收率为109.3%105%，根据10名同学平均回收率的比较(如表8，图3是10名同学平均回收率的散点图），有5名同学的平均回收率在95%~105%之间，另五名同学的平均回收率不在95%~105%之间，说明①本人的所测得的结果准确度不高；②双缩脲法测定血清总蛋白的准确度也不太高。距离理想的准确度有点距离。表810名同学样品回收结果比较平均回收率1.0930.9640.9250.9931.0661.0901.0271.0590.9971.050标准偏差0.0680.0550.0220.0160.0380.0630.0230.0520.0350.030CV%6.2195.6532.3391.5623.5735.7682.2714.8823.5002.882图310名同学平均回收率的散点图75.线性范围评价试验5.1线性范围原理使用不同浓度的蛋白标准溶液，测定各自的吸光度，以蛋白浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，绘制剂量反应曲线，计算双缩脲法的线性关系方程及相关系数。5.2试剂和仪器150g/L蛋白溶液；双缩脲试剂；蒸馏水；分光光度计；水浴箱5.3实验操作5.3.1样品制备（样品2-8用样品1加相应体积蒸馏水配制）检测样品1：150g/L蛋白溶液0.2mL检测样品2：125g/L蛋白溶液0.2mL检测样品3：100g/L蛋白溶液0.2mL检测样品4：75g/L蛋白溶液0.2mL检测样品5：50g/L蛋白溶液0.2mL检测样品6：25g/L蛋白溶液0.2mL检测样品7：5g/L蛋白溶液0.2mL检测样品8：1g/L蛋白溶液0.2mL5.3.2加样和测定表9加样试剂(mL)空白管样品管蒸馏水0.06—样品—0.06双缩脲试剂33注：空白管做一管，8个样品每个做1管，共计1+8=9管。混匀后37℃水浴10分钟或室温放置30分钟，540nm波长比色，空白管调零。5.4结果5.4.1结果记录8表10蛋白样品吸光度测定结果蛋白浓度吸光度蛋白浓度吸光度1g/l-0.00475g/l0.1725g/l0.009100g/l0.20625g/l0.057125g/l0.27250g/l0.121150g/l0.3315.4.2绘制剂量反应曲线以蛋白浓度为横坐标，以各样品吸光度为纵坐标作图，EXCEL绘制吸光度-蛋白浓度曲线，同时计算线性关系方程及相关系数。图4剂量反应曲线5.4.3线性评价从剂量反应曲线结果来看，R2=0.9877，R2偏小，这组数据的线性范围偏差一些，但10名同学测得剂量反应曲线的R2值比较，有7名同学测得的数据R2大于0.995，所以双缩脲法测定血清总蛋白的线性关系还是比较好的。表1110名同学测得剂量反应曲线的R2值0.98770.99380.99580.9970.99850.99270.99570.9960.9980.99976.总结讨论本文介绍双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价，经过配制双缩脲试剂，并用所配双缩脲试剂和标准血清蛋白进行批内重复性试验、回收试验、线性范围测定。在批内重复性试验，变异系数CV%为6.42，比较大，10位同学结果中，有五位同学的结果小于4，另五个同学的结果大于4，双缩脲法测定血清总蛋白的精密度不算太好。在回收试验中，一般要求回收率在95%~105%，本实验测得的平均9回收率为109.3%105%，10名同学平均回收率中有5名同学的平均回收率在95%~105%之间，另五名同学的平均回收率在95%~105%之外，说明①本人的所测得的结果准确度不高；②双缩脲法测定血清总蛋白的准确度也不太高。距离理想的准确度有点距离。在线性范围测定试验中，本实验测得R2=0.9877，R2偏小，但10名同学测得剂量反应曲线的R2值比较，有7名同学测得的数据R2大于0.995，所以双缩脲法测定血清总蛋白的线性关系还是比较好的。如果能排除个人操作误差的因素，双缩脲法测定血清总蛋白的精密度和准确度都不太高，线性关系算好，总的来说，双缩脲法测定血清总蛋白的方法性能不太高。参考文献：1．叶应妩；王毓三；申子瑜全国临床检验操作