动物基因组DNA的提取

实验三动物基因组DNA的提取[实验原理]在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150kb，适用于L嘴菌体构建基因组文库和Southern分析。通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子质量较大的DNA的琼脂糖凝胶电泳技术。[仪器、材料与试剂](一)仪器1.台式离心机2.玻璃匀浆器3．高压灭菌锅4．恒温水浴(二)材料1．1.5mL微量离心管2．微量取样器和吸头3．无菌过滤器(一次性)4．10mL注射器5．鼠肝6．三羟甲基氨基甲烷(Tris)7.十二烷基硫酸钠(SDS)8．乙二胺四乙酸(EDTA)9．蛋白酶K10．RNA酶11．DNA相对分子质量标准物，DNA／EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物(三)试剂1、1.5mol／LNaCl2、0.5mol／LTris·HCIpH8.03．0.5mol／LEDTApH8.04．3mol／LNaAcpH5.2以上均高压灭菌。5．蛋白酶K10mg／mL配好后用一次性过滤器过滤，-20保存(教师配制)6.组织匀浆液100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0)7．酶解液200mmol／LNaCI，20mmol／LTris·HCI(pH8．O)，50mmol／LEDTA(PH8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS8．无DNA酵的RNA酶：将胰RNA酶溶解于10mmol／LTris.HCI(pH7.5)、15mmol／LNaCl溶液中，浓度l0mg／mL，于100℃水浴处理15min，以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，-20℃保存9．TE缓冲液：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25mmol／LEDTA(pH8.0)10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：异戊醇=25：24：1体积比)11．氧仿：异戊醇=24：l(体积比)12．5xTBE5．4gTris，2．75g硼酸2mL0.5mol／LEDTA(pH8.0)，加水到100mL；13．6x上样缓冲液o．25％溴酚蓝，40％(W／V)蔗糖水溶液14．λDNA／EcoRI+／HindⅢ相对分于质量标准物片段(bP)21227，5148，4973，4268，3530，2027，1904，1584，1315，947，831，564，125[实验步骤]本实验在无液氮的条件下，铡备鼠肝DNA，与有液氮条件下相比，产量和质量都有所下降。整个操作过程中，应尽量避免DNA酶的污染，特g4注童动作温和，减少对DNA的机械捌伤。1、取0.2g鼠肝，用冰冷的生理盐水洗3次，然后置于2.0mL匀浆掖中，用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在(冰浴操作，切匆将细胞破碎，可镜检观察)。2、将组织细胞移至1.5ml离心管中，50000rpm离心30-60sec，(尽可能在低温下操作)，弃上清，若沉淀中血细胞较多，可再加入1倍于细胞体积的匀浆液洗一次。3、沉淀加0.8mL无菌水迅速吹散，分两管，再加0.4mL酵解液，翻转混匀(动作一定要轻)55℃水浴处理12-18h；4、沉淀加RNase至终浓度200µg／mL，37℃水浴1h；5、加入等体积酚／氯仿／异戊醇抽提一次，(慢慢旋转混勾，倾斜使两相接触面增大)。4℃、10min、10000rpm离心；6、有时如果DNA含量过高，水相在下层，实验时应注意观察。用扩口吸头移出含DNA的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀)，加等体积氧仿／异戊醇，4℃、10000rrpm离心10rain(若界面或水相中蛋白含量多，可重复1．6操作)。7、用扩口吸头小心吸出上层含DNA的水相，加1／10体积的NaAc，小心混匀(要充分)，再向每管中加入2.5倍体积的无水乙醇，-20过夜。8、12000rpm离心19min，弃上清，75％冷乙醇洗涤一次，12000rpm离心15min室握温干燥(不要大干，否则DNA不易溶解)，加入适量TE缓冲液，存放于4℃，轻摇溶解过夜，即可得到实验动物基因组DNA。9、电泳鉴定DNA，由于基因组DNA相对分子质量较大，用0.3％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，先在底部锦一层1％的支持胶，凝固后再铺上一层0.3％琼脂糖凝胶，插上梳子(枚子不能瑾到的支持胶)。取1.5µL溶解的DNA、1µL上样缓冲液和35µl无菌水混匀后小心上样(可在另一孔加DNA相对分于质量标准)，观察基因组DNA大小，用溴化乙锭染色观察结果。[注意事项]1、操作过程尽量在低温下进行，避免DNA降解。2、琼脂糖凝胶脆弱，应小心操作。3、提取得到的基因组DNA应为单一条带，DNA降解可形成弥散带型。1首先你的上样量太大,可能早晨有些拖尾现象；2点样孔有东西,可能是有蛋白质污染,可以用酚氯仿抽提纯化看看还有没有；3右起第二个样品,可能是RNA没有除干净,有RNA污染,可以用RNase处理一下；4最左边一个样,DNA明显发生部分降解,有拖带.