动物细胞生产药用蛋白工艺的研究进展

动物细胞生产药用蛋白工艺的研究进展学院：专业：姓名：学号：动物细胞生产药用蛋白工艺的研究进展【摘要】近年来，由于哺乳动物细胞具有对重组蛋白质进行正确折叠、装配和翻译后修饰的优点，利用哺乳动物细胞生产医用蛋白质已成为生物制药产业的重要组成部分。应用哺乳动物工程细胞系统生产药用蛋白显示了越来越重要的地位。本文对动物细胞培养技术和提高蛋白质的产量进行了简述。【关键词】动物细胞；药用蛋白；生产工艺近年来，动物细胞培养技术的快速发展极大地推动了现代生物医药产业的发展。这一技术已广泛应用于蛋白质药物研发、疫苗制造、干细胞移植、人造组织器官培养等各个领域，日益成为当今生命科学研究和生物医药开发的强力工具。目前，国内外一些科研机构和高新技术企业正专注于这一领域的研究与开发，并不断获得新的科研成果和技术产品。这些新成果和产品的推广应用正引导着细胞培养工程技术走向当今生物医药领域的技术前沿［1］。重组要用蛋白的翻译后修饰是充分发挥其药理活性、药代动力学行为以及体内稳定性所必需的。这些翻译后修饰包括蛋白的正确折叠、二硫键的形成、多聚化、蛋白酶加工、磷酸化以及充分糖基化，是在内质网和高尔基体内进行的。因此，有必要用哺乳动物细胞表达形容生产治疗用重组活性蛋白，特别是对与结构复杂、分子量巨大，或是二硫键数目多，或糖基化程度高的蛋白。有些天然结构的药用蛋白只能用哺乳动物细胞培养生产。目前，投放市场以及临床中试中的重组蛋白有70%来自哺乳动物细胞培养。随着哺乳动物细胞培养技术的发展和重组药用蛋白的需求，哺乳动物细胞培养生产的药用蛋白正在不断增加[2]。以下就目前动物细胞大规模培养工艺以及提高药用蛋白质量的方法作一简述。1.目前公开发表工艺的研究蛋白治疗药物有单克隆抗体治疗乳腺癌的Herceptin，免疫球蛋白肿瘤坏死因子(TNF)受体融合蛋白治疗类风湿性关节炎的Enbrel和灭活的甲肝疫苗Vaqta等。动物细胞培养技术已经成为一个受到普遍信任的产业化生产技术，并逐步形成商业化操作水平。首先重组治疗药物，主要是重组蛋白或抗体，对产品应用最有代表性的需要是生产产量与质量，其生产形式至少70%是采用搅拌式生物反应器悬浮培养形式，50%以上采用无血清培养；疫苗和组织替代品其产品来源许多不用的细胞系，它需要特殊的生物反应器系统和培养液；虽然用于诊断的产品主要是单克隆抗体，类似于重组治疗，但需求量明显低，这就允许考虑多种特殊的生产形式和生物反应器系统。因此，目前用哺乳动物细胞大规模培养生产蛋白的工业化过程，可以看作是以搅拌式生物反应器悬浮培养作为通用技术平台，使用常用的三种细胞(CHO、SP2P0、NSO)依托该平台工艺并使其生产能力提高。平台工艺的特点是采用无血清培养和成熟的流加和灌流工艺。1.1悬浮细胞培养工艺悬浮培养适于许多细胞培养，如杂交瘤、鼠骨髓瘤(SP2P0，NSO)，对适于贴壁培养的细胞(CHO，BHK)可进行细胞生长形式的驯化。在大规模细胞培养中，细胞死亡是维持细胞高活性和高密度的最大障碍，由于在悬浮培养工艺中，细胞的死亡主要是因凋亡所致。通过导入凋亡抑制基因(Bcl-2)来调节细胞抗凋亡的机制，延长细胞生存时间，促细胞活力和增加抗体的产量。悬浮培养工艺中影响细胞生产数量和质量的因素，主要应考虑细胞培养环境(营养条件、产物积累、pH、温度和渗透压)，终产物(乳酸和氨)毒性累积和必需营养物的添加等。设计适应细胞生长的无血清培养基，控制营养物的添加，减少产物消耗积累是解决问题的有效手段[3]。1.2贴壁细胞培养生物反应器技术已达到相当规模和技术水平。而要更好地符合生物医药产业发展的需要，仍存在诸多不足有待改进和完善。如何开发剪切力低、混合效率高的液体设备系统在动物细胞高密度培养中显得尤为重要，也是制造大规模反应器系统的难题之一［4］。目前报道的贴壁细胞生产工艺，最佳的生物反应器形式是搅拌式微载体悬浮培养系统，最大放大到10000L，并可提供最有效的优化工艺和最适宜的流加工艺设计。最佳的工艺设计是高密度连续灌流培养，最近在30L生物反应器高密度微载体连续灌流培养Vero细胞生产人狂犬疫苗，微载体数量达到25gPL，细胞密度可以达到12@109Pml，这项技术的进步主要是生物反应器提供一个独特的细胞沉降系统，高氧气传输系统，和高营养环境及强的pH缓冲体系[5]。流加培养和灌流培养是动物细胞培养工艺中最常用的两种操作方式。另外可供选择的方式还有批式-反复流加(batchrefeeding)。虽然许多较老的病毒生产工艺采用批式操作(batch)，新的病毒疫苗生产已采用改良的生产形式如批式-反复流加或灌流培养工艺。流加培养工艺的基础是用搅拌生物反应器，营养物的添加主要考虑减少代谢废物的积累和营养的均衡，维持一个高细胞密度和高产物浓度。灌流悬浮培养在生物反应器的设计上必须考虑细胞截流。流加悬浮培养与灌流悬浮培养在操作形式上并无明显不同，两种操作形式的选择完全取决于每个产品潜在的细胞生长活力与相关产物的稳定性，以及产品的最高产量需求和质量要求。2.提高药用蛋白质产量的方法2.1构建高效的表达载体系统构建高效的表达载体系统是提高哺乳动物细胞医用蛋白质产量的首要策略，也是目前制约医用蛋白质产业化的瓶颈。外源基因可以通过质粒载体转染或病毒载体感染的方式导入哺乳动物宿主细胞，表达目的蛋白。传统质粒载体需要转染宿主细胞获得稳定表达，耗时费力，不利于医用蛋白质的大规模生产。目前，病毒载体主要以杆状病毒载体和慢病毒载体最为常用。杆状病毒载体可以通过昆虫细胞大量制备病毒颗粒，感染多种哺乳动物细胞，并在合适的启动子控制下表达外源基因，加上杆状病毒载体具备基因组大、操作性好、靶向性强、生物安全性高等优点，已成为一项比较成熟、安全、经济、高效的蛋白质表达技术，被越来越多地应用于哺乳动物细胞生产多肽药物和疫苗等医用蛋白质的研制。一般来说，人工构建的哺乳动物细胞表达载体为穿梭载体，含有便于载体扩增和大量制备的原核序列，如复制子和抗生素抗性基因等，以及调控外源基因转录与翻译活性的启动子、增强子、终止子和polyA信号序列等真核生物表达序列。优化调节启动子、增强子及其相关转录调控元件有助于高效表达外源基因[6]。2.2筛选高效稳定表达克隆筛选高效稳定表达克隆是提高哺乳动物细胞医用蛋白质产量的另一重要策略。当前常用的筛选高效稳定表达克隆的体系主要有两类：一类是基于氨甲喋呤(methotrexate，MTX)的二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase，DHFR)筛选体系[7]；另一类是基于甲硫氨酸亚砜(methionine-S-sulfoxide，MSX)的谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，GS)筛选体系。DHFR筛选体系是用MTX处理细胞培养物让DHFR周围基因扩增，进而筛选高产量的克隆，在50nmol/L~1μmol/LMTX浓度下，目的基因的基因拷贝数可以提升102~105倍[8]。GS筛选体系利用含有GS基因的载体转染受体细胞，只有多拷贝GS基因的细胞才能在正常MSX浓度生长，进而筛选出高表达细胞株。此外，GS筛选体系可以减少细胞氨的产生。这些都为提高医用蛋白质产量的研究奠定了基础。2.3优化转录水平、翻译水平及翻译后修饰水平从根本上了解目的基因转录、翻译及翻译后修饰水平的分子机制是未来开发新型医用蛋白质和提高医用蛋白质产量的关键。目前常用的方法有以下几种。第一，在载体上添加某些特定序列，使表达载体整合到宿主细胞染色体后模拟高转录活性区，高效表达目的基因。第二，将含有定点重组位点的选择标记基因整合到染色体高表达区域，然后将目的基因载体与重组酶载体共转染到带有重组位点的细胞系，在重组酶介导下表达载体整合入高转录活性区域。蛋白的折叠与组装是产生具有功能蛋白质的重要阶段。然而，相关功能调节蛋白是否参与该过程在很大程度上仍是未知，目前只有很少部分内质网分子伴侣被人们所熟知，如分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(glucoseregulatedprotein78，GRP78/Bip)、蛋白质二硫键异构酶等。因此，通过蛋白质基因的共表达作用来提高重组抗体产量仍然是一个棘手的问题。糖基化是蛋白翻译后修饰水平的核心环节。众所周知，哺乳动物细胞具有与人类相似的聚糖修饰位点。但是，表达的糖基化结构与天然结构相比还存在着差异，特别是位于末端的唾液酸往往缺失或错配，一定程度上影响了目的蛋白质的生产效率和产品的生物活性。因此，糖基化工程已成为增加哺乳动物细胞重组蛋白质产量和活性研究的热点[9]。2.4优化瞬时表达系统瞬时表达系统由于具有相对于稳定表达系统生产周期短、利于大规模生产、适于医用蛋白质的评估以及密码子的优化等优点，现已成为哺乳动物细胞生产医用蛋白质研究的重要技术之一，如利用HEK-293细胞、BHK细胞、CHO细胞等瞬时表达重组蛋白质。然而，目前瞬时表达系统的单位产量和体积产量仍然无法与稳定表达系统相媲美，因此，优化瞬时表达系统，提高重组蛋白质产量仍是研究的重点。虽然目前还没有瞬时表达医用蛋白质的报道，但是随着大规模瞬时表达技术的不断优化，以及产量的不断提高，该技术必将广泛应用于医用蛋白质的规模化生产。2.5优化培养工艺贴壁细胞培养是早期哺乳动物细胞的主要培养方式，但是存在细胞成活率低、不便于大规模生产等缺点。因此，为了提高重组蛋白质产量、降低成本，目前绝大多数在生物反应器中进行的哺乳动物细胞培养都是采用悬浮式培养。然而，让贴壁细胞适应悬浮培养需要特殊的培养基，如今已开发出多种适于悬浮培养的培养基，尤其是无血清培养基。血清培养基具有成分不明确、价格昂贵、存在潜在未知因子污染等缺点，使培养过程难以控制，不利于后续医用蛋白质的纯化。近年来，越来越多新型高通量生物反应器也开始应用于哺乳动物细胞表达重组蛋白质的研究。2011年，Zhou等[10]开发了一种新型家蚕生物反应器，并且通过研究证实该反应器更加适于重组蛋白质大规模生产和临床研究。由此看来，随着新型培养基和生物反应器的研发应用，必将推动哺乳动物细胞医用蛋白质产业更快发展。2.6抑制细胞凋亡当前哺乳动物细胞大规模培养生产医用蛋白质主要被细胞凋亡所阻碍，因此，抑制细胞凋亡是必不可少的措施。目前，通过抑制哺乳动物细胞凋亡来提高蛋白质产量主要从两个方面着手：一方面通过改进培养工艺抑制哺乳动物细胞凋亡，主要包括优化细胞培养条件，开发新型无血清无蛋白培养基，发展新型高通量生物反应器等；另一方面通过基因工程改造来抑制哺乳动物细胞凋亡，如表达抗凋亡基因、编码连锁凋亡抑制因子、过表达抗凋亡蛋白、抑制或敲除前凋亡基因等。引起细胞凋亡的具体机制尚未完全清楚，通过抑制细胞凋亡来提高医用蛋白质产量仍需进一步研究。3.展望随着人类基因组计划、蛋白质组计划的进行，基因的克隆和功能蛋白的鉴定为治疗药物额生产提供了更多的选择，必将促进此产业的飞速发展。不如动物细胞培养生产药用蛋白是个负责的系统工程，它需要众多环节都力求简化经济，并注意各个部分之间的相互作用，同时还包括制剂、包装和冻干的改进，从而达到整体的优化才能面对众多的机遇与挑战。参考文献[1]陈志南,杨向民.基于抗体等重组蛋白表达产品的哺乳动物细胞大规模发酵技术[J].中国医药生物技术,2009,4(5):325-328.[2]林福玉,陈昭烈,黄培堂等.哺乳动物细胞培养生产药用蛋白的关键环节[J].生物技术通讯,2002,13(1):62-65[3]陈文庆,王建超,刘华杰,等.悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的比较分析[J].中国兽药杂志,2010,44(10):37-41．[4]唐江伟,吴振强．新型生物反应器结构研究进展[J].中国生物工程杂志,2007,27(5):146-152.[5]米力,陈志南.动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择[J].中国生物工程杂志,2003,23(7):1-6[6]CacciatoreJJ,ChasinLA,LeonardEF.Geneamplificationandvectorengineeringtoachieverapidandhigh-levelthera