发明专利撰写模板生物类龙图腾网提供一个能用于构建cDNA文库和功能筛选的载体构建的方法

1说明书一种能用于构建cDNA文库筛选的质粒载体的方法技术领域本发明涉及基因工程领域，具体地说是一种能用于构建cDNA文库构建筛选的质粒载体的方法。背景技术目前对于新基因的发现和功能研究往往要经过几次的亚克隆，而对于一个cDNA文库来说，要研究其功能要将整个文库上百万个基因通过亚克隆转移到另一载体上研究功能，就会顾虑低拷贝基因被丢失等问题。而酵母双杂交是常用的筛选基因功能的方法之一，但是很难获得一个cDNA的定向克隆，因此，本发明在酵母双杂交质粒pGADT7的基础上进行改造，获得一个既可用于全长cDNA的定向克隆、文库构建、测序又能用于酵母双杂交的筛选文库的质粒pGADT7M。发明内容本发明的目的在提供一种能用于构建cDNA文库构建筛选的质粒载体的方法，以解决背景技术中的不足。一种能用于构建cDNA文库构建筛选的质粒载体的方法，主要包括以下步骤：1、将空载体pDNR-LIB的一个单克隆质粒，用NdeI和XhoI双酶切后，回收短片段；22、将质粒pGADT7也用NdeI和XhoI双酶切后回收大片段；3、这两个片段通过T4DNA连接酶连接、转化和测序鉴定。这个质粒载体就改造成了酵母双杂交文库的载体，命名为pGADT7M，这个载体上就含有两个SfiI酶切位点，该载体是以pGADT7为基础改造的，具备pGADT7所具备的用于细菌中复制、酵母中复制和表达，和酵母双杂交等所具备的元件：pUCori,Ampr,2μori,LEU2,GAL4AD,PADH1,TADH1,SV40NLS,HATag等。有益效果：本发明获得一个既可用于全长cDNA的定向克隆、文库构建、测序又能用于酵母双杂交的筛选文库的质粒pGADT7M。附图说明：图1pGADT7多克隆位点；图2pDNR-LIB多克隆位点；图3pGADT7M多克隆位点；图4部分重组子的菌落PCR结果图。具体实施方式：以下结合实施例对本发明所涉及一种能用于构建cDNA文库构建筛选的质粒载体的方法作进一步说明。实施例1：一种能用于构建cDNA文库构建筛选的质粒载体的方法：一、cDNA文库构建31总RNA的提取与检测在整个操作过程中戴手套；用新鲜的去离子水（Milli-Q-Grade）溶解RNA，不要用DEPC水，也不要使用灭菌过的水，灭菌时蒸气污染的水会干扰后续的PCR反应。(1)取50-100mg组织样品，用0.75mlTRIZOL®LS试剂匀浆，15-30℃静置5min。(2)加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s后，15-30℃静置2-15min。(3)4℃、12,000g离心15min，取上层水相。(4)加入0.5ml异丙醇，15-30℃静置10min后，4℃、12,000g离心10min，弃上清。(5)再加1ml75%乙醇漂洗沉淀，5,000g离心5min，弃上清，真空干燥去除样品中痕量的乙醇，加入适量无RNase的去离子水。(6)取1l进行1%甲醛变性胶电泳，1l用紫外分光光度计分别测定样品在260nm、280nm波长上的光密度及初步估算RNA的纯度，-80℃保存备用。对提取的RNA进行甲醛变性胶电泳。加样前，甲醛变性胶先预电泳5min，电压降为5v/cm；随后将样品加至凝胶孔，可用已知大小的RNA作分子量标准参照物，按3-4v/cm的电压进行电泳；紫外灯下观察电泳结果。42磁珠法分离mRNA(1)在RNase-free的Eppendorf管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500μl.(2)65ºC加热10min。(3)加入3μl生物素标记的Oligo(dT)和13μl20×SSC于RNA中，轻轻混合，室温放置逐渐冷却至室温，一般需10min左右。(4)同时配0.5×SSC1.2ml和0.1×SSC1.4ml.(5)将磁珠（SA-PMPs）轻晃散开，放入磁性分离架上，使SA-PMPs集中于管的一侧（约30sec），小心去上清，切不可离心。用0.3ml0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠，去除上清，重复3次。(6)将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs应在30min内使用。(7)将（3）中的oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA-PMPs管中，轻轻摇匀，室温下放10min。(8)用磁性分离架捕获SA-PMPs，小心去上清，但不要弃去。用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs悬浮，最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相，而不搅动SA-PMPs.将SA-PMPs重新悬浮在0.1mlRNase-free水中，反复颠倒，使SA-PMPs散开，洗脱mRNA。(9)用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的mRNA吸入另一个新的5Eppendorf管中。(10)将SA-PMPs再悬浮于0.15mlRNase-free的水中，洗脱，与（11）步洗脱液合并。(11)将得到的mRNA溶液取几微升进行凝胶电泳分析，若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录，则需将得到的mRNA溶液浓缩（浓缩步骤见14-18）。(12)加0.1体积的3MNaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中，-20ºC沉淀过夜。(13)4ºC，13,000g离心60min。去上清，加入500μl70%乙醇混匀。(14)4ºC，7,500g离心10min。(15)去上清，真空或空气中自然风干，但不要太干，加适量RNase-free水溶解。(16)重复步骤5-12，将步骤8保留下的样品重新上柱。注意事项：所有操作均需要严格戴手套，戴口罩进行；如果totalRNA质量高，杂质少，就选择Oligotex的方法分离mRNA，相反则可以用磁珠法。3cDNA的合成按CLONTECH公司SMARTTMcDNALibraryConstructionKit说明书操作。其原理是利用真核生物mRNA5’端的甲基化G（m7G）且5’三磷酸键连接的特殊的帽子结构和3’端的PolyA尾的特点设计锚定引物,分别进行第一链合成，引物延伸合成第二链，酶切消化和柱回收cDNA，从而实现富集全长cDNA6的目的。1）cDNA第一链的合成在5µl反应体系中加入下列组分（于冰上操作）：1µg芋螺毒腺mRNA，SMARTIVolignucleotide和CDSIII∕3’PCR引物各1µl，以超纯水补齐体积，混匀，短暂离心。72℃温育2min，冰浴2min，短暂离心，使混合物集于管底。依次加入2µl5×FirstStrandBuffer、1µl20mmol/L的DTT、1µl10mmol/L的dNTPMix和1µlPowerScriptRT（CLONTECH）后轻弹管壁，混匀并短暂离心。置PCR仪42℃反应1hr逆转录合成第一链，冰浴终止反应。加入1µlNaOH,68℃放置30min,冰上冷却，短暂离心，-20℃保存。2）引物延伸法扩增cDNA第二链在100l的反应体系中加入下列组分：11l第一链产物，10×Advantage2PCRBuffer10l，50×dNTPsMix2l，20μmol/L上下游锚定引物各2l，50×Advantage2PolymeraseMix2l和超纯水80l补齐体积，然后将全部反应物混匀，放入预热至95℃的PCR仪，运行如下反应程序：95℃变性1min后，继续循环程序95℃15sec、68℃8min共3个循环，冷却至4℃后取5lPCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。剩余PCR产物于-20℃保存。3）蛋白酶K消化在50l上一步的PCR产物（2-3gdscDNA）中加入2l蛋白酶K(20g∕l)灭活DNApolymerase，45℃温育20min，再经酚/氯仿/异戊醇（25：724：1）和氯仿/异戊醇（24：1）混合液各抽提一次，取上清，加入10µl的3M乙酸钠，1.3µl的糖原（20µg/µl），260µl的室温放置的95%乙醇，室温14,000g离心20min，用80%乙醇洗涤沉淀，空气干燥，加入79µl去离子水充分溶解沉淀。4）SfiI酶切消化在100l的酶切体系中加入下列组分：79l的dscDNA，10l10×SfiIBuffer，1l100×BSA和10lSfiI内切酶。充分混匀，短暂离心。50℃温育2hr后，加入2l1%的二甲苯腈蓝（xylenecyanol）混匀。5）cDNA的分级分离柱回收将上一步酶切消化好的dscDNA上样到预处理好的CHROMASPIN-400柱，分管收集大小不一的dscDNA，每管1滴，当收集完16滴后，盖上柱子上盖；从每支收集管中取出5μl样品进行电泳检测，1%琼脂糖凝胶电泳确定符合要求的收集管号，集中后加入0.1倍体积的3MNaAc（pH4.8）、1.3µl的20mg/ml糖原及2.5倍体积的95%乙醇，-20℃放置沉淀过夜；室温14,000g离心20min；吸去上清，沉淀用80%乙醇洗涤，室温14,000g离心5min，吸去上清，沉淀在空气中干燥10min左右；用7µl去离子水溶解干燥后的dscDNA，-20℃保存备用，也可直接与载体连接。4dscDNA与载体的连接建立如下三个连接反应体系,同时设定对照反应体系，16℃连接16hr，8以确定最佳连接比例。加95µl灭菌的DEPC水到每个管中，加1.5µl甘糖原。吸打混匀。加入280µl冰冷的95％乙醇，混匀。-70℃放置1-2hr。15,000g室温离心20min。小心移走上清，干燥沉淀。分别用5µlDEPC水溶解干燥的核酸沉淀。组分连接A(µl)连接B(µl)连接C(µl)cDNA0.51.01.5pDNR-LIB(0.1µg/µl)1.01.01.010×LigationBuffer0.50.50.5ATP(10mM)0.50.50.5T4DNALigase0.50.50.5去离子水2.01.51.0总体积(µl)5.05.05.05cDNA文库的转化1）电转化感受态细胞的制备(1)挑取单克隆菌落，投入盛有10mlLB液体培养基的三角瓶中（同时做培养基的空白对照）。37℃，220rpm，培养14-16个小时。(2)第二天，以1:100的比例将这10ml菌液倒入1000mlLB液体培养9基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。(3)将菌液在冰上预冷30min，随后将菌液分装到500ml预冷的离心杯中，4℃，2500g离心10min。(4)弃上清，离心杯中加入少量去离子水，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4,000g离心10min。(5)弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000g，4℃，离心10min。(6)弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油,4℃,4,000g,离心10min。(7)弃上清，每个离心杯中加入5ml10％的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300μl/管分装于1.5ml的离心管中，-80℃冰箱中保存。(8)同时取100μl感受态加0.01ngpUC18直接电穿孔转化，检测转化效率。(9)次日观察转化子生长情况，并记录。2）电转化连接产物电转化DH5α感受态细胞：每100µl菌液加入5µl连接产物或对照质粒溶液，混匀，转入电转化杯，冰浴不超过5min，用卷纸擦干外壁，马上置于BioRad电穿孔仪进行电击，电转化参数：电压2.0kV；电流25µF；电阻200Ω；电击时间4.5ms。电击后立刻与800µl37℃预热的SOC培养基10混合，用枪混匀，尽量吸出杯内菌液，装于干净无菌的离心管中。37℃、225rpm复苏细胞1hr，稀释103，104，105分别涂布于Cm+的LB平板上，37℃培养箱中倒置培养12-16hr，观察菌落生长情况，统计文库滴度。转化产物4℃存放备用。3）电击杯清洗流程用清水将电击杯稍冲一下。向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。加入无水乙醇2ml