发酵技术考前复习资料

一、绪论发酵：已经从过去简单的生产酒精类饮料、生产醋酸和发酵面包发展到今天成为生物工程的一个极其重要的分支，成为一个包括了微生物学、化学工程、基因工程、细胞工程、机械工程和计算机软硬件工程的一个多学科工程。现代发酵工程不但生产酒精类饮料、醋酸和面包，而且生产胰岛素、干扰素、生长激素、抗生素和疫苗等多种医疗保健药物，生产天然杀虫剂、细菌肥料和微生物除草剂等农用生产资料，在化学工业上生产氨基酸、香料、生物高分子、酶以及维生素和单细胞蛋白等。（理解记忆）发酵的定义：通过微生物的生长繁殖和代谢活动，产生和积累人们所需产品的生物反应过程。发酵工程定义：也称为微生物工程，是指利用微生物的生长繁殖和代谢活动来大量生产人们所需产品过程的理论和工程技术体系，该体系主要包括菌种选育、保藏和扩大生产，微生物代谢产物的发酵生产和分离纯化制备，以及微生物生理功能的工业化利用等在发酵技术中一般包括微生物细胞或动植物细胞的悬浮培养，或利用固定化酶，固定化细胞所做的反应器加工底物（即有生化催化剂参加），以及培养加工后产物大规模的分离提取等工艺。主要是在生物反应过程中提供各种所需的最适环境条件。如酸碱度、湿度、底物浓度、通气量以及保证无菌状态发酵工程组成：上游工程、发酵工程、下游工程发酵方法的类别：a.根据对氧的需要区分：厌氧和有氧发酵；b.根据培养基物理性状区分：液体和固体发酵；c.根据从微生物生长特性区分：分批发酵和连续发酵发酵流程：保藏菌种→斜面活化→扩大培养→种子罐→主发酵（这两个步骤加入灭菌的空气和碳源、氮源、无机盐等营养物质）→产品分离纯化→成品工业发酵步骤和工艺流程：(1)用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制(2)培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌(3)将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中(4)将接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物(5)将产物抽提并进行精制，以得到合格的产品(6)回收或处理发酵过程中产生的废物和废水发酵原料的预处理：原料不同处理方法也有所差异。1.淀粉——利用前需变成糊精或葡萄糖方法：酸水解（高压、耐酸）、酶水解法2.糖蜜——加热杀菌和用水冲稀，也可加酸处理后再补充无机盐3.碳氢化合物：石油脱蜡——一定馏分的石油经冷却脱蜡而获得的凝固点在-10℃的油，加入适量无机盐进行接种发酵斜面培养：菌种：已有的优良生产菌种和选育的新菌种方法：一般都是由保存于冷冻管及砂土管或冰箱中的斜面菌种开始，在正式使用前要先转接到新鲜斜面培养基上活化后，再用于种子扩大培养。发酵方式：固体发酵（适合于传统发酵工艺及乡镇企业用来生产比较简单的产品）液体深层发酵（适合于大规模工业化生产）影响发酵的因素；如温度、pH、通风、搅拌、罐压力等等，必须适当地控制影响发酵的各种条件，掌握发酵的动态，并进行杂菌的检查和产物测定，使整个发酵过程顺利进行发酵产物的分离提取：eg：a.利用菌体：离心沉淀或板框压滤法使菌体与醪液分开，也可以用喷雾干燥法直接做成粉剂。b.酒精——发酵醪蒸馏塔蒸馏；c.抗菌素及有机酸——根据产物的不同特性，采用离子交换树脂吸附处理、脱色过滤、减压浓缩等方法提取精制。(获得的产物都要按照有关部门制定的国家标准进行质量检验和性能测定，符合要求后才为合格产品)发酵工程的有关历史：（1）天然发酵阶段：古代酿酒、酿醋等。（2）纯培养技术的建立：巴斯德，科赫等。人为地控制微生物的发酵进程。（3）通气搅拌发酵技术的建立：1929年Flemming爵士发现了青霉素，从此生产技术产品中增加一大类新的产品—抗生素；20世纪40年代，以获取细菌的次生代谢产物—抗生素为主要特征的抗生素工业成为生物发酵工业技术的支柱产业（4）代谢控制发酵技术：20世纪50年代，氨基酸发酵工业又成为生物技术产业的又一个成员。实现了对微生物的的代谢进行人工调节，这又使生物技术进了一步20世纪60年代，生物技术产业又增加了酶制剂工业这一成员（5）开拓发酵原料时期：70年代，为了解决由于人迅速增长而带来的粮食短缺问题，进行了非碳水化合物代替碳水化合物的发酵，如利用石油化工原料进行发酵生产，培养单细胞蛋白，进行污水处理，能源开发等（6）基因工程阶段：80年代以来，随着重组DNA技术的发展，可以按人类社会的需要，定向培养出有用的菌株，这为发酵工程技术引入了遗传程的技术，使生物技术进入了一个新的阶段发酵工业的范围：1、以微生物细胞为产物的发酵工业2、以微生物代谢产物为产品的发酵工业3、以微生物酶为产品的发酵工业4、生物转化或修饰化合物的发酵工业5、微生物废水处理和其他生产微生物细胞物质：定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻类、担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳定期产量最高。微生物酶发酵：酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺提高产量。分类：胞内酶和胞外酶。生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意微生物代谢产物发酵：包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所产生的，来自于中间代谢产物和初级代谢产物。微生物的生物转化：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物。最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的微生物特殊机能的利用：a.利用微生物消除环境污染b.利用微生物发酵保持生态平衡c.微生物湿法冶金d.利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域发酵工程的特点：1、利用微生物的特点；发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌，酵母菌和霉菌。利用微生物的特点：(1)对周围环境的温度、压强、渗透压、酸碱度等条件有极大的适应能力（2)有极强的消化能力(3)有极强的繁殖能力2、发酵反应过程的特点：a．采用可再生资源作为主要原料，因而来源丰富，价格低廉，过程中废物的危害性较小，但由于原料的成分复杂，往往难以控制会给产品质量带来一定的影响。b.由于采用的是生物催化剂，反应过程一般在常温常压下进行。但生物催化剂易受环境的影响和杂菌的污染，因而很易失活，难以长期使用。c.与一般化工产品相比，其生产设备比较简单，能耗较低。但某些生物反应由于其特殊性质而使反应基质浓度和产物浓度均不能太高，这是因为微生物细胞或生物酶受底物浓度或产物浓度的抑制或不能耐高渗透压所致，不仅使反应器体积增大，而且也加大了提取的困难，因而反应器生产效率较低。d.尽管生物反应过程成本低，应用广。但反应极力复杂，较难检测与控制。反应液中杂质多，给分离提纯带来了困难。发酵反应过程分类：1.酶催化反应过程：采用游离酶或固定化酶为催化剂时的反应过程。生物体中所进行的反应几乎都是在酶的催化下进行的。工业生产中所用的酶，或是经提取分离得到的游离酶，或是固定在多种载体上的固定化酶2.微生物反应过程：采用活细胞为催化剂时的反应过程。这既包括一般的微生物发酵反应过程，也包括固定化细胞反应过程和动植物细胞的培养过程。3.废水的生物处理过程：它是利用微生物本身的分解能力和净化能力，除去废水中污染物质的过程。废水的生物处理过程特点；a.由细菌等菌类、原生动物、微小原生动物等各种微生物构成的混合培养系统几乎全部采用连续操作系统b.微生物所处的环境条件波动大c.反应的目的是消除有害物质而不是代谢产物和微生物本身发酵工业的意义与展望：a.利用遗传工程等先进技术，人工选育和改良菌种采用发酵技术进行高等动动植物细胞培养b.固定化技术广泛应用c.开发和采用大型节能高效的发酵装置，自动控制将成为发酵生产控制的主要手段d.应用代谢控制技术，发酵生产氨基酸e.将生物技术广泛地用于环境工程二、菌种扩大培养菌种扩大培养定义：菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子。种子必须具备的条件：①菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐中能迅速生长②生理性状稳定③菌体总量和浓度能满足大容量发酵罐的要求④无杂菌污染（不带杂菌）⑤生产能力稳定种子制备过程：a.实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等或液体摇瓶培养b.生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养实验室种子制备：在砂土管或冷冻干燥管内保藏的菌种以无菌的方式接至适合的斜面培养基上，培养成熟后挑选正常的菌落再接一次试管斜面并至摇瓶；生产车间种子制备：实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到种子罐进行扩大培养；种子罐培养一方面使菌种获得足够的数量，另一方面种子罐中的培养基更接近发酵罐培养的醪液成分和培养条件，譬如通无菌空气，搅拌形式等等，以使菌体适应发酵环境种子罐级数的确定：种子罐的级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数；对于生长快的细胞，种子用量的比例少，即需要的接种量少，所以相应的种子罐也少接种种龄和接种量：接种龄，种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间；接种量，接种量指的是移入的种子悬浮液体积和接种后培养液体的体积的比例；种子质量的判断种子质量的控制措施：菌种稳定性的检查：将保藏菌株溶于无菌的生理盐水中，逐级稀释，然后在培养皿琼脂固体培养基上划线培养，长出菌落，选择形态优良的菌落接入三角瓶进行液体摇瓶培养，检测出生产率高的菌种备用；杂菌检查：显微镜观察，或平板培养试验，即将种子液涂在平板培养皿上划线培养，观察有无异常菌落，定时检查，防止漏检砂土管（冷冻干燥管）→斜面→摇瓶（或者固体斜面）→种子罐→发酵罐以啤酒麦芽汁为例：斜面→10ml试管（25—27℃/2-3d）→500—1000ml三角瓶子（250—500ml麦芽汁/25℃、2d）→5—10L麦芽汁（15—20℃/3—5d）→发酵罐三、灭菌灭菌的必要性：1.使生物反应的基质或产物，因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降。2.杂菌也会产生代谢产物，这就使产物的提取更加困难，造成得率降低，产品质量下降。3.有些杂菌会分解产物，使生产失败。4.杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pH值，使反应异常。5.如果发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，使生产失败。灭菌的定义：用物理或化学的方法杀灭或去除物料或设备中所有生命物质的过程灭菌的方法：1化学药剂灭菌：某些化学药剂能与微生物细胞物质发生反应而具有杀菌作用。如甲醛、氯（或次氯酸钠）、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐（如新洁尔灭）等。因化学药剂也会与培养基中的一些成分产生作用，而且加入培养基中后不易去除，所以化学药剂灭菌不用于培养基灭菌；2射线灭菌：紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的高能粒子能起到灭菌的作用。波长为2.537×10-7的紫外线有灭菌效果。但由于其穿透力低，所以只用于表面消毒和空气消毒。X射线和由Co60产生的γ射线也可灭菌。3干热灭菌：160℃保温1h。主要针对必须保持干燥的实验器具或材料（培养皿、接种针、固定化细胞用的载体材料等）。4湿热灭菌：湿热灭菌为最基本的灭菌方法，因为蒸汽穿透能力强，且在冷凝时放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀灭微生物。但如果利用蒸汽直接通入培养基中加热灭菌，应考虑扣除冷凝水的体积，否则会降低培养基的浓度。湿热灭菌一般是在120℃维持20～30min。5过滤除菌：这是利用过滤方法阻拦微生物达到除菌的目的。工业上利用此方法制备无菌空气。在产品的提取中，也可用过滤的方法（如超滤）处理料液，以得到无菌产品。培养基灭菌：培养基的灭菌有分批法和连续法两种。分批灭菌是将配制好的培养基放入发酵罐中，通入蒸汽，使培养基和所有设备一起灭菌。这一过程也称为实罐灭菌。连续灭菌是在配制好的培养基向发酵罐输送的同时加热、保温和冷却，完成整个灭菌过程。连续灭菌时间短，灭菌温度一般