发酵制药_巩健_子学习情境4教案

1子学习情境4青霉素发酵任务一青霉素的结构和理化性质一、β-内酰胺类抗生素特性和作用机制1.结构特性都含有一个四元的内酰氨环，并通过N与相邻的碳原子和另外一个杂环相稠合。2.物理性质白色或黄色无定型或结晶性固体。熔点不明显，具有旋光，酸性形式易溶于有机溶剂，盐易溶于极性溶剂，特别是水。3.化学性质化学性质活泼，由于稠环的作用，青霉素的内酰胺环很易开环，头孢菌素相对稳定。4.作用机制通过抑制肽聚糖转肽酶及D-丙氨酸羧肽酶的活性抑制肽聚糖的合成，从而干扰细胞壁的合成。二发展概况1929Fleming首先发现青霉素可抑制葡球菌的生长，但并未获得足够重视1940FloreyChain青霉菌发酵液中提取出了青霉素1945意大利Brotzu发现头孢菌素C1958后人工合成半合成青霉素、头孢菌素陆续发现头霉素、克拉维酸、硫霉素、单环β-内酰胺三常用的β-内酰胺类抗生素（一）青霉素：苄青霉素、青霉素V、氨苄西林、替卡西林、甲氧西林、氯唑西林(一)头孢菌素头孢菌素C、头霉素C、头孢力行、头孢克洛、头孢唑啉、头孢西丁、头孢他啶（一）新型β-内酰胺四、天然存在的青霉素青霉素是一族化合物的总称。分子式：2R为侧链，根据R基不同青霉素GC6H5CH2-青霉素XHOC6H4CH2-青霉素FCH3CH2CH=CHCH2-青霉素KCH3(CH2)6-双氢青霉素FCH3(CH2)4-青霉素VC6H5OCH2-五、青霉素的理化性质（一）稳定性干燥纯净的青霉素盐很稳定，有效期都在三年以上，并且对热稳定，如结晶青霉素钾盐在150OC加热1.5小时效价不降低。青霉素水溶液PH=5-7较稳定。最稳定的PH为6-6.5。（一）溶解度青霉素在水中溶解度小，易溶于有机溶剂青霉素盐易溶于水、甲醇（二）降解反应青霉素遇酸、碱、加热易开环，倒是抗菌活性丧失。详见课本（三）紫外吸收光谱在252nm257nm264nm具有弱的吸收峰（四）过敏反应任务二发酵法工艺过程现代抗生素生产绝大多数采用发酵法生产，虽然种类繁多，但其基本过程大致相同。菌种――孢子制备――种子制备――发酵――发酵液的预处理及过滤――提取及精制――成品检验――成品包装――出厂检验。一般说，从孢子制备到发酵属于“生物合成”范围从预处理到提取精制属于化工范围一生产菌种菌种是发酵生产的基础，必须产量高、性能稳定、容易培养。为防止菌种衰退，要合理保藏。一般保存在沙土管或冷冻于干燥管中。一般使用期为１－２年，不断纯化淘汰变异菌种。有条件的可以菌种选育，不断提高产量。3二、孢子制备孢子制备是发酵工序的开端，孢子的质量、数量对以后菌丝体的生长繁殖有很大的影响。不同菌种的孢子制备工艺是不同的。（一）.放线菌类培养基：人工合成固体培养基，C源N源不要太丰富。以利于产生大量孢子温度：大多28土1CO部分菌种30CO或者37时间：（因菌种不同而异）一般4-7天保存：2-4CO冰箱保存一周左右放线菌发酵生产的工艺过程如下：采用哪一代的斜面孢子接入液体培养，视菌种特性而定。采用母斜面孢子接人液体培养基有利于防止菌种变异，采用子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。菌种进入种子罐有两种方法。一种为孢子进罐法，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接人种子罐。此方法可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工艺过程简单、便于控制孢子质量筹优点，孢子进罐法已成为发酵生产的一个方向。另一种方法为摇瓶菌丝进罐法，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培养时间。（二）.霉菌类培养基：天然培养基（大米、小米、麦麸）工艺过程：沙土管----斜面-----亲米----生产米----种子罐首先将保存于沙土管中或冷冻管中的菌种孢子接种在斜面上，恒温培养，孢子成熟后制作成孢子悬浮液然后接种到大米或小米等培养基上，恒温成熟后称为“亲米”，由亲米再转至大米或小米培养基上，培养成熟后称为“生产米”，用生产米介入种子罐内，培养温度一般为25-28度，培养时间一般为4-14天。（三）.细菌类培养温度：37CO少数为28CO培养时间：多数1-2天有的芽孢需要5-6天，甚至十多天（四）影响孢子质量的因素及其控制菌种母斜面（孢子）子斜面（孢子）摇瓶种子（菌丝）种子罐发酵罐41、原材料质量的影响多数抗生素产生菌对原材料敏感。如：四环素斜面孢子与小麦麸皮质量关系密切，小麦的产地、品种、加工方法、成份用量对孢子质量均有影响。青霉素的大米孢子，由于大米产地、颗粒大小、均匀程度不同如：琼脂的牌号不同对孢子的质量也有影响。原因是不同的琼脂含有不同的无机离子。如：水质。污染，硬度大。人工调节2、.培养条件的影响1.温度：如：链霉素（灰色链霉菌）斜面孢子，在26.5—27.5CO正常生长，超过28就不能正常生长。土霉素产生菌在36.5-37CO，超过37CO，孢子早熟易老化2.相对湿度北方控制在40-45%，南方控制在35-42%（三）冷藏时间的影响总的原则是易短不易长，一般不超过7天。（四）孢子龄及孢子量的影响过于年轻的孢子经不起冷藏，过于衰老的孢子生产能力下降，控制在孢子成熟、孢子量多、效价正常时为宜。孢子量过多或过少，对发酵也是不利的。小结：本节介绍了青霉素的结构和作用机理。介绍了发酵生产抗生素的菌种制备过程和孢子培养过程。三、种子制备种子制备是将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。(一)摇瓶种子制备某些孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进人种子罐，这就是摇瓶种子。目的就是让孢子发芽长成健壮的菌丝。摇瓶种子进罐，常采用母瓶、子瓶两级培养，有时母瓶种子也可以直接进罐。培养基：其培养基配方和培养条件与种子罐相似，要求比较丰富和完全，易被菌体分解利用，氮源丰富有利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓，子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近种子罐的培养基配方。5（二）种子罐种子制备孢子悬浮液或摇瓶种子接入种子罐后，在罐内繁殖成为大量菌丝的过程，从而缩短了发酵罐繁殖菌丝的时间，增加了抗生素合成时间。1种子罐级数因抗生素品种不同，可分为一级种子、二级种子、三级种子。a一级种子（二级发酵）：将孢子或摇瓶种子接种到体积较小的种子罐中，培养繁殖成为大量菌丝体，然后接种到发酵罐发酵。这样的种子称为一级种子，利用一级种子进行发酵的过程称为二级发酵。如：青霉素、四环素、头孢菌素b二级种子（三级发酵）将制备的一级种子接入体积较大的种子罐，培养繁殖更多的菌丝，然后转入发酵罐发酵。如：红霉素、卡那霉素、庆大霉素c.三级种子（司级发酵）如：链霉素2.种子罐级数的确定根据菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及所采用发酵罐的容积而定。生长快的细菌，种子用量比例少，种子罐相应也少，生长慢的菌种种子罐级数要多。种子罐的级数越少，越有利于简化工艺，并可减少染菌机会。改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。3.接种龄和接种量a.接种龄接种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。接种龄以菌丝体处于生命力极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为合适。过于年轻的种子会出现前期生长缓慢、发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟，甚至会因菌丝量过少而在发酵罐内结球，造成异常发酵。过老的种子会引起生产能力下降而菌丝过早自溶。嗜碱性芽孢杆菌产生碱性蛋白酶的接种龄试验情况，以12h为接种龄所得的酶活力最高。6接种量接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。大多数抗生素最适接种量为7%~15%，有时可增加到20%~25%接种量的大小取决于菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。采用较大的接种量可以缩短菌丝繁殖时间，使抗生素的形成提前到来。但是，如果接种量过多，往往使菌丝生长过快，培养液黏度增加，造成溶解氧不足，影响产物的合成。如：嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶1%接种量产酶活力最高，在0.5%~4%接种量之间虽有差别，但影响不大，一旦超过4%则产量明显下降。(三)、影响种子质量的因素及其控制种子质量主要受孢子质量、培养基、培养条件、种龄和接种量等因素的影响。1.培养基a营养成分丰富培养基营养成分应适合种子培养的需要，易于被菌体吸收和利用氮源和维生素含量较高，可使菌丝粗壮并具有较强的活力。b.尽量与发酵罐接近要尽可能地和发酵培养基接近，入罐后容易适应发酵罐的培养条件。c.要略稀薄发酵培养基一般比较浓，而种子培养基以略稀薄为宜。d.pH值要比较稳定pH值的变化会引起各种酶活力的改变，对菌丝形态和代谢途径影响很大。2．培养条件a.温度种子培养应选择最适温度。b.通气搅拌培养过程中通气搅拌的控制很重要，各个不同时期的需氧量不同，一般前期需氧量较少。7后期需氧量较多。在青霉素生产的种子制备过程中，充足的通气量可以提高种子质量。例如，将通气充足和通气不足两种情况下得到的种子都接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。通气搅拌不足可引起菌丝结团、菌丝粘壁等异常现象。c.消泡生产过程中，有时种子培养会产生大量泡沫而影响正常的通气搅拌，此时应严格控制，甚至可考虑改变培养基配方，以减少发泡。d.补料在种子罐培养一定时间后，补入一定量的种子培养基，结果种子质量有所提高，菌丝团明显减少，菌丝粗壮，发酵单位增高。3.种子异常分析在生产过程中，种子质量受各种各样因素的影响，种子异常的情况时有发生，会给发酵带来很大的困难。种子异常往往表现为菌种生长发育缓慢或过快、菌丝结团、菌丝粘壁三个方面。a．菌种生长发育过快或过慢菌种在种子罐生长发育缓慢或过快和孢子质量以及种子罐的培养条件有关。生产中，通入种子罐的无菌空气的温度较低或者培养基的灭菌质量较差是种子生长、代谢缓慢的主要原因。生产中，培养基灭菌后需取样测定其pH值，以判断培养基的灭菌质量。b．菌丝结团在液体培养条件下，繁殖的菌丝并不分散舒展而聚成团状称为菌丝团。这时从培养液的外观就能看见白色的小颗粒，菌丝聚集成团会影响菌的呼吸和对营养物质的吸收。如果种子液中的菌丝团较少，进入发酵罐后，在良好的条件下，可以逐渐消失，不会对发酵产生显著影响。如果菌丝团较多，种子液移入发酵罐后往往形成更多的菌丝团，影响发酵的正常进行。菌丝结团与搅拌效果差、接种量小有关，一个菌丝团可由一个孢子生长发育而来，也可由多个菌丝体聚集一起逐渐形成。c．菌丝粘壁菌丝粘壁是指在种子培养过程中，由于搅拌效果不好，泡沫过多以及种子罐装料系数过小等原因，使菌丝逐步粘在罐壁上。其结果使培养液中菌丝浓度减少，最后就可能形成菌丝团。以真菌为产生菌的种子培养过程中，发生菌丝粘壁的机会较多。四、发酵过程的控制（一）温度变化及其控制81、温度对发酵的影响温度影响微生物的生长发育和代谢活动。因为一切代谢活动都依赖于酶。而酶的活力只有在最适才能发挥。温度低于最适范围，菌体生长缓慢；高于最适范围，酶易过热失活，使菌体自溶，发酵周期缩短，影响抗生素产量。发酵最适温度低于最适生长温度几度。如：产黄青霉菌最适温度为27-28OC,分泌青霉素的最适温度为26OC小单胞菌………………34-36OC,分泌庆大霉素………………32-34OC温度不仅影响菌体生长与合成速度，甚至影响合成方向例如，30OC金霉素金色链霉菌35OC四环素2、发酵最适温度的选择所谓最适温度是指最适于产生菌生长或合成抗生素的温度。注意：a.抗生素在发酵周期内一般不能只选择一个最适温度。“马克思主义矛盾论”例如，青霉素产生菌生长最适温度为30℃，但产生青霉素的最适合成温度是24.7℃。在生长初期，抗生素还未开始合成，以促进菌丝体生长繁殖为目的，应该选择最适生长温度；当菌丝浓度达到一定程度，到了抗生素分泌时，生物合成成为主要方面，就应该满足生物合成的最适宜温度。如：发酵前期保持在28℃，40h之后改为27-27.5℃，放罐前24h，在增加到28℃，链霉素产量明显增加。b.发酵温度的选择还需参考其他发酵条件灵活掌握如：通气条件较差，一般温度较低为宜。因为温度较低可以相应增加氧的溶解度，菌丝生长速度也可减慢，从而弥补发酵供氧不足。(二)PH的影响及控