叶利民的微生物实验教案

实验1培养基的配制一、实验目的和内容目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。内容：1．牛肉膏蛋白陈培养基的配制。2．高氏1号培养基的配制。3．马丁氏培养基的配制。二、实验材料和用具牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/LNaOH、lmol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O。试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等。三、操作步骤（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂15～20g，水1000mL，PH7.4～7.61．称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2．加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。3．调pH检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用lmol/LHCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。4．过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。5．分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。6．加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。7．包扎加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以5支或7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。8．灭菌将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应故人冰箱内暂存。9．摆斜面灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的1/2。10．无菌检查将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24～48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。（二）高氏l号培养基的配制高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，琼脂15～20g，水1000mL，pH7.4～7.6。l．称量和溶解先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在1000mL中加入1g的FeSO4·7H2O，配成浓度为0.01g/mL的贮备液，再在1000mL培养基中加入以上贮备液1mL即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。2．pH调节、分装、包扎及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。（三）马丁氏培养基的配制马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下：K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，琼脂15～20g，水1000mL，自然pH。1．称量和溶解先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需的水中。待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000mL培养液中加入以上孟加拉红溶液3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。2．分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白膝培养基配制。3．链霉素的加入链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1%的溶液(配好的链霉素溶液保存于-20℃)，在100mL培养基中加1%链霉素0.3mL，使每毫升培养基中合链霉素30μg。四、注意事项称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。调pH时要小心操作，避免回调。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。五、实验报告记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。六、问题和思考l．配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?2．培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查?3．试设计实验对饮料进行无菌检查。实验2高压蒸汽灭菌一目的要求1．了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。2．学习高压蒸汽灭菌的操作方法。二基本原理高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表2—1），二是湿热的穿透力比干热大（表2—2），三是湿热的蒸汽有潜热存在。1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。表2—1蛋白质含水量与凝固所需温度的关系卵白蛋白含水量/%30分钟内凝固所需温度/℃50562574～801880～9061450160～170在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见（表2—3）表2-2干热温热穿透力及灭菌效果比较温度/℃时间/h透过布层的温度/℃灭菌20层10层100层干热130-1404867270.5不完全湿热105.33101101101完全表2—3灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系压力数全部空气排出时的温度/℃2/3空气排出时的温度/℃1/2空气排出时的温度/℃1/3空气排出时的温度/℃空气全不排出时的温度/℃MpaKg/cm2Ib/in20.030.355108.81009490720.070.7010115.6109105100900.1010.515121.31151121091000.141.4020126.21211181151090.171.7525130.01261241211150.212.1030134.6130128126121现在法定压力单位己不用磅和kg/cm2表示，而是用Pa或bar表示，其换算关系为：1kg/cm2=98066.5Pa；1Ib/in2=6894.76Pa.一般培养基用0.1Mpa（相当于15Ib/in2或1.05kg/cm2），121.5℃,15～30min可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0.06Mpa（8Ib/in2或0.59kg/cm2）112.6℃灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以0.1Mpa,121.5℃灭菌20min即可，而盛于大瓶内的培养基最好以0.1Mpa，122℃灭菌30min。实验中常用的非自控高压蒸汽灭菌锅有卧式（图2-2，A）和手提式（图2—2，B）二种，其结构和工作原理相同，本实验以手提式高压蒸汽灭菌锅为例，介绍其使用方法，有关自控高压蒸汽灭菌锅（autoclave）的使用可参照厂家说明书。三器材牛肉膏蛋白胨培养基，培养皿(6套一包)，手提式高压蒸汽灭菌锅等。四操作步骤1．首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。切勿忘记加水，同时水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。2．放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。3．加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加到逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa，121.5℃，20min灭菌。灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。5．灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。6．将取出的灭菌培养基，需摆斜面的则摆成斜面，然后放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。五实验报告l．结果检查培养基灭菌是否彻底。2．思考题（1）高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽?灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？（2）在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素?（3）灭菌在微生物实验操作中有何重要意义?（4）黑曲霉的孢子与芽孢杆菌的孢子对热的抗性哪个最强?为什么?实验3土壤的稀释分离、纯化微生物及无菌操作技术一、实验目的和内容目的：学习从土壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术。内容：l．用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌。2．用平板划线方法分离微生物。3．学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。二、实验材料和用具金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和普通变形菌(Proteusvulgaris)斜面菌种。已灭菌的牛肉膏、高氏1号、土豆蔗糖固体培养基各1瓶，49.5mL无菌水(带玻璃珠)1瓶，4.5mL无菌水6管，80%乳酸，10%酚液，95%乙醇。无菌培养皿12套，1mL无菌移液管10支，土壤样品及天平、称量纸、药勺、试管架、玻璃铅笔、橡皮头(用75%乙醇浸泡)、玻璃刮。三、操作步骤(一)土壤稀释分离1．取土壤取表层以下5—10cm处的土样，放入无菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。2．制备稀释液(要无菌操作)(1)制备土壤悬液：称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的49.5mL无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡5～10min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。(2)稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-8的稀释液(图3-1)。注意：操作时管尖不能接触液面，每一