功能标记引物设计交流汇报

1功能标记发展交流汇报（2010年）汇报人：李晓燕等位基因分析是基因功能分析的重要手段，也是设计育种筛选和利用优良基因的重要前提。它既可以用于候选基因的功能分析，为基因克隆服务；又可以用于已克隆基因的等位基因分析，进一步挖掘已克隆基因的功能。因此等位基因分析可以用于任何一个基因座的分析，具有非常广阔的应用前景。我们实验室主要研究的是：对已克隆的基因进行等位基因分析。等位基因分析是利用基因的已知序列去分析基因的自然变异。已知基因序列是等位基因分析的前提，分析等位基因变异是对基因功能的进一步挖掘和对基因认识的进一步完善。由于图位克隆的基因本身是自然变异的，因此存在复等位基因的可能性较大，是开展等位基因分析的主要研究对象。标记的发展：RandomDNAmarkers(RDMs)：Themarkersderivedatrandomfrompolymorphicsitesinthegenome,e.g.RFLP,AFLP,SSR….Genetargetedmarkers(GTMs)：Themarkersderivedfrompolymorphismswithingenes.Functionalmarkers(FMs)：（功能标记）Themarkersderivedfrompolymorphicsiteswithingenescausallyaffectingphenotypictraitvariation.（AndersenandLübberstedt,2003,TrendsinPlantScience,8:554-560）.等位基因标记是最重要的功能标记，因为它不但位于基因序列，而且与等位基因的功能直接相关。等位基因的差异，在DNA序列上主要表现为SNP，也有些属于插入/缺失。因此，只要找到DNA序列上的差异，就能够设计功能标记。一：功能标记发展的基本步骤1、查阅目标基因的相关文献，特别是基因克隆的文献，明确等位基因的表型差异和序列差异，以及它们之间的关系。网站：（图书馆）（google）（NCBI）等等。2、序列查询根据克隆基因时提供的信息，获得该基因的序列。可在NCBI完成。2可以通过注册号查询：在克隆该基因时进行提交的序列信息，现在大多数期刊要求提供该注册号。注册号一般在文章中都可以查询到。（Accessionnumber）。也可以通过该基因直接查询，在NCBI中也可以直接输入该基因名，进行相关的序列以及文献等查询。还可以通过序列进行搜索比对查询获得。3、找到引起表型变化（引起功能变化）的序列下载相关基因的序列信息。根据克隆时的信息，进行分析，找出导致功能变化的序列。（可以直接从文献中获得相应的位置，或者进行2个等位基因序列的BLAST）。例如：Hd6基因相关信息：文献中获得序列上的差异：在编码区内：nipponbare和kasalath这两个等位基因之间只有一个核苷酸的差异。该核苷酸（如下图）：在nipponbare是一个提前终止的密码子TAG，编码一个提前终止的CK2a，结果翻译成一个没有功能的蛋白质；而在kasalath等位基因的编码区内，这个核苷酸是一个赖氨酸密码子(AAG)，这样kasakath编码一个有功能的CK2a。可以说在hd6座位上的nipponbare等位基因是自然发生的一个无效突变体。3Nipponbare（早熟）2761caaaagggagattaaaatacttcagaatctttgtggaggtccaaacattgtgtagcttct2821tgatattgtcagagatcaacattctaagactcctagcttgatctttgaatatgtcaacaa2881tacagacttcaaagtgctgtaccccacgttgacagattatgatatccgctactacatataKasalath（晚熟）2761atcaaaagggagattaaaatacttcagaatctttgtggaggtccaaacattgtgaagctt2821cttgatattgtcagagatcaacattctaagactcctagcttgatctttgaatatgtcaac2881aatacagacttcaaagtgctgtaccccacgttgacagattatgatatccgctactacata4、设计引物若是SNP引起的功能变化则设计扩增特异SNP位点的引物。SNP引物设计基本原理：首先设计一条公用的引物，两条特异的扩增相应等位基因的引物。这两条特异的引物除了在3'的几个核苷酸不同外，其余的碱基基本一样，在3'特异的与一种等位基因相结合，而且人为的在其倒数的第三或者第四个碱基的位置引进一个错配，并且特异引物的长度差异最少要保证在5个碱基以上，这样经过PCR后才能直接通过电泳检测出待测材料的基因型。根据实验室功能标记发展小组的经验。我们在设计等位基因特异长度PCR的时候需要注意以下事项：（1）PCR产物的长度在100-150bp；（2）引物的GC含量一般要相近，其含量在40%-60%；（3）引物的TM值要相近，这样才能保证在进行3引物同管扩增的时候有一个合适的扩增条件；（4）对于PCR体系的要求较高，需要进行不同的测试；（5）对于扩增条件来说也需要进行测试，需要改变循环数或者进行梯度PCR等来获得一个比较好的扩增产物。实例分析：HD6功能标记的发展：设计等位基因引物（功能标记），利用这4个碱基的差异进行，把这个碱基的差异放在前引物的3’端。设计引物扩增目标片段长度约100bp，2个等位基因扩增时之间有4个碱基的长度差异。HD6功能标记引物设计情况（实验室功能标记名称统一为基因符号大写）名称序列TMGC%产物长度表型HD6-F1CTTTgTggAggTCCAAACATTATgT59.740111bpnipponbare(早）HD6-F2ggAggTCCAAACATTgCgA5852.6105bpkasalath(晚）HD6-RCAgCACTTTgAAgTCTgTATTgTTg59.740若是插入/缺失引起的功能变化，则设计扩增该插入缺失区段的相应引物，如红米基因等。以其为目标区域进行扩增，则扩增产物长度的不同就代表不同的基因型。二：引物设计基本原则以及注意事项引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primerlength），产物长度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability,用ΔG值反映)，形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构（duplexformationandhairpin）的能值，在错配位点（falseprimingsite）的引发效率，引物及产物的GC含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。引物设计应注意如下要点：1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但一般不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进5修饰位点或标记物。4.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。5.引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(thenearestneighbormethod)。6.ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。7.引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。8.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。三：软件介绍PrimerPremier5.0的使用技巧简介“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计()、限制性内切酶位点分析()和DNA基元(motif)查找()。“Premier”还具有同源性分析功能（），但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA与蛋白序列的互换（）、语音提示键盘输入（）等等使用步骤及技巧6“Premier”软件启动界面如下：进行引物设计时，点击按钮，界面如下：7进一步点击按钮，出现“searchcriteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目的（SeachFor）有三种选项，PCR引物（PCRPrimers），测序引物（SequencingPrimers），杂交探针（HybridizationProbes）。搜索类型(SearchType)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sensePrimer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（CompatiblewithSense/Anti-sensePrimer）。另外还可改变选择区域（SearchRanges），引物长度（PrimerLength），选择方式（SearchMode），参数选择（SearchParameters）等等。8使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然后按，随之出现的SearchProgress窗口中显示SearchCompleted时，再按，这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为100，即各指标基本都能达标（如下图）。点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“PeimerPremier”主窗口，如图所示：9该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（FalsePriming），及上下游引物之间二聚体形成情况（CrossDimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，