关节损伤再灌注-改后.

战（创）伤致骨关节缺血再灌注损伤的机制与防治应用中国人民解放军第89医院全军创伤骨科研究所王成琪．王剑利．孙新君．郑宪友．赵成．张伟旭．刘光军战创伤致骨关节缺血再灌注损伤比较常见，四肢血管损伤、断肢再植、止血带超时应用以及肢体过长时间的挤压等均可造成缺血再灌注损伤。骨关节、滑膜、软骨等缺血再灌注损伤的机制与防治，是研究的重点。为此设多个专题进行研究：一、骨关节、滑膜缺血再灌注损伤二、软骨缺血再灌注损伤三、骨关节其它软组织缺血再灌注损伤四、防治方法的研究一、关节滑膜缺血再灌注损伤模型的建立在股动脉处切开皮肤，游离股动静脉、股神经；于股骨中段逐层结扎并切断除股骨、股动静脉、神经以外的皮肤及各层肌肉；环形游离长约0.5cm的骨膜并用牙科磨钻开窗，用明胶海绵填塞阻断髓腔血流，然后用血管夹夹闭股动静脉造成远端肢体缺血。8小时后，放松血管夹恢复肢体血运。a图:连续夹闭4小时，动静脉未见明显异常。abcb图:连续夹闭6小时，动脉内见血栓形成，血管内皮细胞（EC）有脱落。abcc图:连续夹闭6小时，血管变形，动脉内见血栓形成。abc滑膜缺血与损伤的时效关系指标检测分别于阻断血流后0h、4h、6h、8h、10h活杀动物，立即取材。光镜观察正常滑膜组织正常滑膜组织，由1-3层滑膜细胞和其下的组织构成。a图:缺血4小时，滑膜组织轻度水肿。abcdb图:缺血6小时，滑膜组织水肿，间质血管有大量的红细胞。abcdc图:缺血8小时，滑膜组织水肿，毛细血管内皮细胞（EC）肿胀。abcdd图:缺血8小时，滑膜下层组织出现核碎裂、和溶解等坏死变化。abcd关节滑膜HE染色×400单纯I/RI1天,可见滑膜细胞间质水肿，其间散在数量不等的多形核粒细胞，伴有毛细血管充血，且管壁不完整，内有含铁血黄素。关节滑膜HE染色×400关节单纯I/RI2周，滑膜间质水肿加重，见表层滑膜细胞有坏死脱落，间质内多形核白细胞（PMN）明显浸润。关节滑膜HE染色×100关节单纯I/RI4周，可见滑膜细胞及滑膜下层血管减少，滑膜间质疏松，伴有巨噬细胞浸润。关节滑膜HE染色×100单纯I/RI12周，滑膜组织乳头状增生，呈细小绒毛状向腔内突出，表面被覆滑膜细胞，间质内伴有大量巨噬细胞浸润。电镜观察缺血6小时，血管内皮细胞、滑膜细胞出现线粒体肿胀，嵴突变短；缺血8小时，还可观察到胞核染色质凝块的出现；缺血10小时，滑膜细胞染色质边集、粗面内质网脱颗粒和胞浆分泌颗粒减少，以致核碎裂等细胞坏死的表现;小血管内皮细胞胞膜出现髓鞘样变，胞浆突起、空泡形成，细胞紧密连接变松弛，胞膜破坏、崩解。关节滑膜透射电镜×3000单纯I/RI2周内,可见滑膜细胞肿胀，细胞核染色质边集，核周隙明显增宽，细胞核周围出现空泡；胞浆内线粒体可出现髓样变、空泡样变。关节滑膜透射电镜×2000单纯I/RI2周，可见血管内皮细胞肿胀明显，胞核变小，胞浆出现空泡样变，线粒体等细胞器明显减少。关节滑膜透射电镜×1400单纯I/RI12周，滑膜细胞仍有肿胀，细胞核不规则，核仁明显，核周隙明显增宽，胞浆内质网扩大。关节滑膜缺血再灌注损伤机制1．组织IR过程中由于激活了次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统，产生大量的活性氧自由基（ROS）；血管内皮细胞（EC）由于缺血缺氧及活性氧自由基（ROS）作用，可能促使多形核白细胞（PMN）粘附并侵入到组织间隙；多形核白细胞（PMN）在此过程中因呼吸爆发产生更多的活性氧自由基，当这些活性氧自由基的量超过组织的清除能力时，则导致组织细胞损伤，器官功能形态遭到破坏。2．我们动态观察了脂质过氧化产物丙二醛（MDA）、多形核白细胞（PMN）及超氧化物歧化酶（SOD）在滑膜IR损伤和修复中的变化，以及它们与滑膜组织结构和关节活动改变的关系。实验方法动物分组实验动物55只，根据缺血后再灌注的时间不同，随机分成11组，每组5只；再灌注时间分别为1h、3h、6h、12h、24h、72h和1w、2w、4w、8w、12w，一侧后肢为实验侧，另一侧后肢为自身对照侧(不施行手术)。滑膜组织丙二醛含量和多形核白细胞记数缺血组4、6、8、10小时滑膜组织中丙二醛（MDA）的变化与正常组无显著性差异（P0.05）。0501001502002501h3h6h12h24h72hIR后时间MDA含量(nmol/g)MDA实验侧MDA对照侧*******再灌注组2周内，实验侧丙二醛（MDA）含量呈双峰变化，IR1小时达第一个峰值，随后逐渐降低，IR6小时再次升高，72小时达第二个峰值，然后又逐渐降低。0501001502002501w2w4w8w12wIR后时间MDA含量(noml/g)实验侧对照侧****IR实验侧滑膜组织丙二醛（MDA）在IR2周时仍显著高于自身对照侧（P0.05）；IR2-8周丙二醛持续在低水平，12周又有所回升。0510152025301h3h6h12h24h72h术后时间PMN(个/高倍视野)PMN实验侧PMN对照侧***滑膜组织中多形核白细胞（PMN）浸润自IR后6小时开始升高，72小时达峰值，随后逐渐降低。0510152025301w2w4w8w12w术后时间PMN(个/高倍视野)实验侧对照侧***早期以中性粒细胞为主，两周后为巨噬细胞所代替。IR6小时-72小时滑膜组织丙二醛含量（MDA）与多形核白细胞（PMN）记数显著相关（r=0.66，P0.05）。IR及修复过程中超氧化物歧化酶SOD的变化滑膜组织中超氧化物歧化酶（SOD）自缺血6小时开始降低，再灌注12小时达最低点，然后回升，再灌注8周，基本恢复正常。020406080100正常1h3h6h12h24h72h1w2w4w8w12wIR后时间SOD的含量Nu/mlSOD*********关节活动度的变化缺血再灌注最初2周，实验侧肢体活动明显减少；4周时活动较2周时有所增加，但仍以对照侧肢体为主；8~12周，双侧肢体均参与活动及持重，但可见到明显的跛行。术侧膝关节损伤后被动活动度逐渐降低。0204060801001204w8w12术后时间（周）关节活动度（度）实验侧对照侧***滑膜组织病理学变化a图:IR3小时滑膜组织正常。a1图:IR实验侧滑膜组织水肿，血管内血栓形成，血管内皮细胞肿胀、脱落。abca1b1c1b图:IR12小时对照侧滑膜组织间质水肿，血管充血。b1图:实验测滑膜间质出血，表层结构破坏脱落至关节腔。abca1b1c1c图:IR72小时对照侧间质明显水肿。c1图:实验侧见细小血管破裂成为灶性出血。abca1b1c1a图:IR1周滑膜组织灶性坏死，关节腔面有渗出物。a1图:对照侧无明显异常。aba1b1b图:IR2周实验侧，滑膜下层开始修复，间质内有大量的成纤维细胞及炎细胞；新生毛细血管出现结构类似肉芽组织。b1图：对照侧结构正常。aba1b1二、肢体缺血再灌注后关节软骨病理变化的研究关节软骨病理变化大体病理观察：IR侧早期关节软骨与对照侧相比无差别，4周后软骨失去原有光泽，色泽暗淡，暗红或淡黄色。光学显微镜观察IR侧肢体1天和3天组，关节软骨表面平坦，柱状层细胞排列整齐，细胞核大多有偏移、缩小现象；1周、2周组软骨细胞排列紊乱，层次不清，胞核缩小甚至消失，软骨细胞碎裂、坏死，软骨陷窝内细胞数目较对照侧减少；4周、8周组关节软骨表面粗糙，表层细胞有脱落现象，柱状层细胞稀少、排列紊乱，12周组软骨表面甚至出现裂纹。肢体IR后关节软骨组织学变化HE染色×200A图：正常对照侧，表面光滑，软骨细胞排列整齐，核大小均匀，潮线清晰可见。肢体IR后关节软骨组织学变化HE染色×200B图：IR后3天,表面平坦，柱状层细胞排列整齐，核偏移。肢体IR后关节软骨组织学变化HE染色×200C图：IR后2周,关节面粗糙，细胞数目减少，排列紊乱，胞核缩小、偏移。肢体IR后关节软骨组织学变化HE染色×200D图：IR后3个月,细胞数目减少，排列紊乱，软骨增厚，潮线增多、前移、模糊。透射电镜IR侧1天组，线粒体轻度肿胀，嵴消失，内织网扩张，胞浆内出现大量的脂滴；3天组，细胞高度肿胀，染色质边集，部分细胞出现溶解坏死，胞膜溶解，胞核碎裂。1周、2周组坏死细胞数量增加，胞核固缩、碎裂；4周、8周组仍可见到高度肿胀和溶解坏死的细胞，胞内残存有细胞器，12周组，可见较多的成软骨细胞，呈梭形，胞浆内大量粗面内织网和线粒体，新生软骨细胞数目增多，有分裂现象。肢体IR后关节软骨细胞超微结构观察（×14K）A图：对照侧关节软骨细胞，胞膜完整，核形态基本正常，未见细胞器肿胀。肢体IR后关节软骨细胞超微结构观察（×7K）B、C图：IR后1天，变性软骨细胞，线粒体肿胀，内织网扩张，胞核变形、偏移，胞浆内出现大量脂滴。肢体IR后关节软骨细胞超微结构观察（×7K）D图：IR后1天，肿胀、坏死软骨细胞，胞膜表面微绒毛消失，细胞器及胞核溶解。肢体IR后关节软骨细胞超微结构观察E图：IR后3天，软骨细胞高度肿胀，胞核固缩，细胞器溶解，胞膜基本完整。（×7.0K）F图：IR后1周，大量软骨细胞溶解。（×2.9K）肢体IR后关节软骨细胞超微结构观察G图：IR后2周，可见溶解坏死软骨细胞，胞膜破裂，细胞器溶解，胞核碎裂。（×7.0K）H图：IR后1月，仍见坏死的软骨细胞（×1.85K）肢体IR后关节软骨细胞超微结构观察I图：IR后1月，出现梭形成软骨细胞。（×7.0K）J图：IR后2月，成软骨细胞数目增多，可见分裂的软骨细胞。（×2.1K）肢体IR后关节软骨细胞超微结构观察K图：IR后3月，见分裂的软骨细胞。（×10.0K）L图：IR后3月，新生软骨细胞数目增多。（×2.1K）扫描电镜IR侧1周－2周内软骨表面出现小的凹陷，“垄沟”尚在，但变浅，表面可见散在的炎性细胞；4周、8周组，“垄沟”排列基本消失，软骨表面凹凸不平；12周组软骨表面出现细小浅表的裂缝，胶原暴露，基质丢失。肢体IR后关节软骨表面扫描电镜观察A图：IR后1天，表面有均匀分布的“垄沟”，呈平行排列，相邻距离相等，垄表面光滑，高度和深度基本一致。（×1000）肢体IR后关节软骨表面扫描电镜观察B图：IR后1周，“垄沟”尚在，深浅不均，连续性差。（×1000）肢体IR后关节软骨表面扫描电镜观察C图：IR后1月，“垄沟”排列消失，软骨表面凹凸不平。（×500）肢体IR后关节软骨表面扫描电镜观察D图：IR后3月，软骨表面出现的裂隙，胶原纤维暴露，表面不平坦。（×1000）关节软骨内MMP3的表达与分布肢体IR后1天组，关节软骨内阳性颗粒较少，主要分布在胞浆内；3天组明显增多，阳性颗粒在胞浆和基质中均有分布；至1周和2周组渐升高达峰值，之后表达逐渐回落，但8周-12周组仍高于对照侧。组化SP法检测IR后关节软骨内MMP3的表达A图：对照侧关节软骨胞外基质很少着色，阳性细胞少，染色淡。（DAB染色×200）组化SP法检测IR后关节软骨内MMP3的表达B图：IR后1天，关节软骨内出现较少阳性细胞，阳性染色主要在细胞内。（DAB染色×400）组化SP法检测IR后关节软骨内MMP3的表达C图：IR后3天，阳性细胞增多，主要集中在表层，胞外基质有着色。（DAB染色×400）组化SP法检测IR后关节软骨内MMP3的表达D图：IR后1周，大量染色阳性细胞，胞外基质同时着色。（DAB染色×400）组化SP法检测IR后关节软骨内MMP3表达E图：IR后2周，阳性细胞多，着色深。（DAB染色×400）组化SP法检测IR后关节软骨内MMP3表达F图：IR后4周，在大量阳性细胞周围，可见基质的阳性染色。（DAB染色×400）组化SP法检测IR后关节软骨内MMP3表达G图：IR后8周，表层细胞有脱落，柱状层染色阳性细胞多。（DAB染色×400）组化SP法检测IR后关节软骨内MMP3表达H图：IR后12周，表层细胞脱落严重，细胞数目减少，但仍见强染色细胞。（DAB染色×400）关节内MMP3的合成较正常增多，并在关节内广泛分布，与关节软骨基质的降解有关。刺激MMP3表达的因素，考虑可能是肢体缺血再灌注后释放大量的自由基和炎症细胞因子，如：一氧化氮（NO）、白