化妆品中颜料橙(CI12075)等五种禁用着色剂的检测方法

附件15：化妆品中颜料橙5等5种禁用着色剂的检测方法1适用范围本方法规定了唇膏、散粉和指甲油类化妆品中酸性黄36（CI13065）、颜料橙5（CI12075）、颜料红53:1（CI15585:1）、苏丹红Ⅱ（CI12140）和苏丹红Ⅳ（CI26105）的高效液相色谱测定方法。本方法适用于唇膏、散粉和指甲油类化妆品中酸性黄36、颜料橙5、颜料红53:1、苏丹红Ⅱ和苏丹红Ⅳ的测定。2方法提要样品经溶剂提取后，用高效液相色谱仪分离，二极管阵列检测器检测，以保留时间和紫外-可见光谱图定性，峰面积外标法定量。必要时，采用液相色谱-质谱联用法进行确证。本方法对酸性黄36、颜料橙5、颜料红53:1、苏丹红Ⅱ和苏丹红Ⅳ的检出限、定量下限、检出浓度和最低定量浓度见表1。表15种着色剂的检出限、定量下限、检出浓度和最低定量浓度着色剂名称检出限（ng）定量下限（ng）检出浓度（μg/g）最低定量浓度（μg/g）酸性黄362.05.03.06.0颜料橙52.05.03.06.0颜料红53:15.08.04.010.0苏丹红Ⅱ2.05.03.06.0苏丹红Ⅳ2.05.03.07.03试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为实验室用一级水。3.1乙腈，色谱纯。3.2甲醇，色谱纯。3.3四氢呋喃，色谱纯。3.4二甲基亚砜。3.5乙醇，色谱纯。3.6四丁基氢氧化铵，浓度为55%。3.7柠檬酸。3.8氨水，浓度为25～28%。3.9酸性黄36，纯度≥99%。3.10苏丹红Ⅳ，纯度≥94%。3.11苏丹红Ⅱ，纯度≥90%。3.12颜料橙5，纯度≥97%。3.13颜料红53:1，纯度≥95%。3.14酸性黄36标准储备溶液（=500μg/mL）：称取酸性黄36（3.9）对照品50mg（精确至0.1mg），置于100mL容量瓶中，用甲醇（3.2）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得500μg/mL的标准储备溶液。3.15苏丹红Ⅳ标准储备溶液（=500μg/mL）：称取苏丹红Ⅳ（3.10）对照品50mg（按实际含量折算，精确至0.1mg），置于100mL容量瓶中，用四氢呋喃（3.3）和乙腈（3.1）混合液（体积比1:9）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得500μg/mL的标准储备溶液。3.16苏丹红Ⅱ标准储备溶液（=500μg/mL）：称取苏丹红Ⅱ（3.11）对照品50mg（按实际含量折算，精确至0.1mg），置于100mL容量瓶中，用乙腈（3.1）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得500μg/mL的标准储备溶液。3.17颜料橙5标准储备溶液（=250μg/mL）：称取颜料橙5（3.12）对照品25mg（按实际含量折算，精确至0.1mg），置于100mL容量瓶中，用四氢呋喃（3.3）、二甲基亚砜（3.4）和乙腈（3.1）的混合溶液（体积比5:1:4）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得250μg/mL的标准储备溶液。3.18颜料红53:1标准储备溶液（=250μg/mL）：称取颜料红53:1（3.13）对照品25mg（按实际含量折算，精确至0.1mg），置于100mL容量瓶中，用二甲基亚砜（3.4）和乙醇（3.5）的混合溶液（体积比2:3）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得250μg/mL的标准储备溶液。3.19着色剂混合标准储备溶液（=50μg/mL）：分别称取酸性黄36标准储备液（3.14）、苏丹红Ⅳ标准储备溶液（3.15）和苏丹红Ⅱ标准储备溶液（3.16）各5mL，取颜料橙5标准储备溶液（3.17）和颜料红53:1标准储备溶液各10mL，置于50mL容量瓶中，用乙腈（3.1）溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度各为50μg/mL的标准溶液。3.205种禁用着色剂系列标准溶液：精密量取一定体积的混合标准储备溶液（3.20），置10mL容量瓶中，加乙腈（3.1）稀释至刻度，使得着色剂各成分的浓度分别为0.2μg/mL、0.5μg/mL、2.0μg/mL、10.0μg/mL、50.0μg/mL。4仪器4.1高效液相色谱仪：配二极管阵列检测器。4.2液相色谱-串联四极杆质谱联用仪。4.3分析天平：感量为0.0001g。4.4分析天平：感量为0.00001g。4.5精密移液器。4.6涡旋振荡器。4.7超声波清洗仪。4.8高速离心机：转速不小于10000rmp。5分析步骤5.1样品预处理唇膏类：称取0.5g（精确至0.001g）样品，置10mL具塞比色管中，加四氢呋喃（3.3）与乙腈（3.1）混合液（体积比1:9）至刻度，摇匀，涡旋振荡使试样与提取溶剂充分混匀，超声提取30min，放至室温，必要时，转移至10mL具塞塑料离心管中，以10000rpm离心5min，上清液经0.45μm滤膜过滤，滤液作为试样溶液备用。散粉类：称取0.5g（精确至0.001g）样品，置10mL具塞比色管中，加四氢呋喃（3.3）、二甲基亚砜（3.4）和乙腈（3.1）混合液（体积比1:1:8）至刻度，混匀，超声提取30min，放至室温，上清液经0.45μm滤膜过滤，滤液作为试样溶液备用。指甲油类：称取0.5g（精确至0.001g）样品，置10mL具塞比色管中，加5~6mL乙腈（3.1），混匀，超声提取30min，放至室温，加乙腈（3.1）稀释至刻度，摇匀，静置，必要时，转移至10mL具塞塑料离心管中，以10000rpm离心5min，上清液经0.45μm滤膜过滤，滤液作为试样溶液备用。若样品中被测成分的浓度超过了线性范围的上限，需对试样溶液进行适当稀释处理。5.2高效液相色谱参考条件色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）。流动相：A：乙腈B：缓冲溶液（10mmol/L四丁基氢氧化胺（3.6），10mmol/L柠檬酸（3.7），用氨水（3.8）调节至pH8.2)梯度洗脱，洗脱程序见表1。表1梯度洗脱程序时间（min）流动相A（%）流动相B（%）流速（mL/min）0.0030701.05.0080201.010.0010001.015.0010001.020.0030701.022.0030701.0流速：1.0mL/min。检测波长：416nm（酸性黄36）；484nm（颜料橙5、颜料红53:1、苏丹红Ⅱ）；514nm（苏丹红Ⅳ）。柱温：30℃。进样量：10µL。5.3样品测定按设定的色谱条件（5.2），取着色剂系列标准溶液（3.20）分别进样，进行高效液相色谱分析，以系列标准溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，建立标准曲线，得到回归方程。取试样溶液（5.1）进样10μL分析，色谱图检出的成分，经与该成分的保留时间和紫外-可见光谱图比较确证后，根据测定成分的峰面积，代入回归方程计算各着色剂的浓度。按“6”项下计算公式计算化妆品样品中着色剂的含量。5.4平行试验按以上步骤操作，对同一样品独立进行测定，获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。5.5阳性结果确证测定过程中若有阳性结果，可采用液相色谱-质谱联用法进一步确证。在相同的实验条件下，如果检出的色谱峰的保留时间和紫外-可见光谱图与对照品一致，所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子对相对丰度比的偏差不超过表2规定范围，则可判定样品中存在对应的待测成分。表2阳性结果确证时相对离子丰度比的最大允许偏差相对离子丰度＞50%＞20%至50%＞10%至20%≤10%允许的相对偏差±20%±25%±30%±50%液相色谱-质谱联用法参考条件：色谱参考条件：色谱柱：C18（2.1mm×150mm,3.5μm）；流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液系统梯度洗脱，梯度洗脱条件见表3；柱温：30℃；流速：0.3mL/min；进样量：5µL。表3梯度洗脱条件时间（min）乙腈（%）0.1%甲酸溶液（%）流速（mL/min）0.0078220.33.0078220.35.009550.37.009550.38.0078220.3质谱参考条件：毛细管电压：3.5kV；二级锥孔电压：5V；射频透镜电压：0.5V；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：1000L/hr；锥孔气流量：50L/hr；碰撞室压力：3.2×10-3mbar；低质量端1分辨率：13.0；高质量端1分辨率：13.0；离子能量1：0.5V；碰撞室入口电压：-2eV；碰撞室出口电压：1eV；低质量端2分辨率：13.0；高质量端2分辨率：13.0；离子能量2：0.5V；光电倍增器电压：650V；碰撞气体：氩气；数据采集模式：多反应监测。在以上色谱、质谱条件下，5种禁用着色剂的定性离子对和保留时间见表4。表45种禁用着色剂的定性离子对和保留时间着色剂名称定性离子对（m/z）保留时间（min）颜料橙5339.2/156.2，339.2/128.22.56酸性黄36354.2/169.2，354.2/109.23.33颜料红53:1377.2/221.2，377.2/128.24.11苏丹红Ⅳ381.4/128.2，381.4/106.25.40苏丹红Ⅱ277.2/156.2，277.2/128.25.966计算w=ρV/m式中：w——样品中着色剂的质量分数，μg/g；——从标准曲线中得出的测试溶液中着色剂的质量浓度，μg/mL；V——样品定容体积，mL；m——样品取样量，g。7回收率和精密度两个浓度水平中，低浓度的平均提取回收率和平均方法回收率在80%~120%之间，并且RSD小于10%（n=6）；高浓度的平均提取回收率和平均方法回收率在85%~115%之间，并且RSD小于5%（n=6）。8色谱图min2.557.51012.51517.52022.5mAU020406080100DAD1A,Sig=416,4Ref=off(ZSJFIVE\POWDERLEVEL2011-08-0320-01-54\LINE000009.D)6.9907.50710.11813.09017.1271416nmmin2.557.51012.51517.52022.5mAU020406080100DAD1B,Sig=484,4Ref=off(ZSJFIVE\POWDERLEVEL2011-08-0320-01-54\LINE000009.D)6.9907.50710.11813.09017.127234484nmmin2.557.51012.51517.52022.5mAU020406080100DAD1C,Sig=514,4Ref=off(ZSJFIVE\POWDERLEVEL2011-08-0320-01-54\LINE000009.D)6.9907.50710.11813.09017.1275514nm图15种禁用着色剂混合标准溶液（5μg/mL）色谱图1.酸性黄36；2.颜料红53:1；3.颜料橙5；4.苏丹红Ⅱ；5.苏丹红Ⅳ