冬虫夏草菌无性阶段的分离和鉴定

真菌学报8(1):35-40,1989ActaMycologicaSinica冬虫夏草菌无性阶段的分离和鉴定刘锡[王+进]郭兰英(中国科学院微生物研究所,北京)俞永信曾纬浙江省中药研究所,杭州(四川省中药研究所,重庆)摘要:分离工作在四川康定及北京进行。方法是将康定收集的14批新鲜冬虫夏草，经整体灭菌后,分别割取子座、柄和虫体三部，然后将各部切割成绿豆大小样的接种体，置于含1%胨的PDA上，在20℃温箱中让其生长；也少量地进行了子囊孢子分离，结果获得90%以上是同一种分生孢子阶段真菌的培养物。而且对该培养物的鉴定表明,是被毛孢属(Hirsutella)一新种__中国被毛孢(Hirsutellasinensissp.nov.)。并根据这些多批次且大数量接种体(1000个以上)、多途径且重复持续分离,连同子囊孢子分离以及1988年康定点上再次分离的相互验证,皆得到同一种真菌-----中国被毛孢这一事实,我们初步结论:中国被毛孢是冬虫夏草菌[Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.]的无性阶段。关键词:冬虫夏草菌；中国被毛孢冬虫夏草（DongChongXiaCao）系一种虫生真菌、Cordycepssinensis（Berk.）Sacc.寄生于鳞翅目蝙蝠蛾（Hepialusspp.）的幼虫所成，是一种药用和食用的珍品。在我国古代已对其价值有较广泛而深刻的认识并较早地由我国传入世界各地，特别是东南亚地区。近年来随着国内外的深入研究，进一步认识到冬虫夏草于人体的滋补和医疗方面的重要性。从而促使现阶段需求量激增，而自然资源又深感不足，所以一些研究机构在积极地进行人工栽培技术的研究，但由于菌种的分离方法不当和其无性阶段的报导有所混淆，影响了人工栽培工作的进展。为此，我们于1987年赴四川康定产地进行了冬虫夏草菌的分离和培养。现报道此菌分离物，即冬虫夏草菌无性阶段的特征和鉴定的结果。菌种的分离培养（一）供试采集物除在康定市场购买2批外，其余16批采集物系先后赴各产地点上收集的新鲜、质佳、完整的冬虫夏草。此外，还在点上收集了正在掷射的子囊孢子于培养基上，并连同一批新鲜冬虫夏草经过处理带回北京保存和分离。（二）组织分离将收集来的18批采集物中的14批在康定陆续进行组织分离。方法是每批采集物大多选5条、仅2批选2条的新鲜完整的冬虫夏草进行表面灭菌处理之后，将每一条分割成子座、柄和虫体三部分，然后再将子座切成5-6块、柄部3-4块、虫体8-9块作为接种体，分别接种于10g胨/1000mlPDA或10g蚕蛹煎汁/1000mlPDA上（试验中发现二者对菌生长几无差别），置20℃温箱中培育。此外，在北京还按上述方法少量地将虫体进行组织分离、或将子座和虫体用无菌镊子掰开，直接取其中心白色菌丝组织接种于培养基上。（三）子囊孢子分离在康定点上取含子囊孢子待放的子座进行灭菌，在无菌条件下将整个子座的两端使悬于培养皿盖上，然后将此盖盖于盛有培养基的培盖皿上，或将子座用细线拴其柄部悬吊于陈PDA斜面试管内。以上方法均可获得子囊孢子，再经处理带回北京镜检，挑取萌发的子囊孢子分别移殖于73个斜面试管中，置20℃温箱内让其生长。（四）结果分离工作主要在康定进行，在北京也进行了组织分离和子囊孢子分离，以便获得资料与康定的相互验证。在康定的大量分离中，接种了1000多个接种体，其中有900多个发生的真菌是同一种分生孢子阶段菌。其余的近10种杂菌，大多是真菌，也有细菌，由于它们的出现没有规律性，所以易于识别和汰除。在北京进行的子囊孢子分离中，分别移殖的73个萌发子囊孢子的斜面试管，除2管污染外，只有18管长出同组织分离一致的真菌（1986年四川省中药研究所也从子囊孢子中分离到一株这种菌），其余的虽未污染却久久不再生长，嗣后取出其接种体镜检仍能清楚看到萌发的子囊孢子。另外，北京的组织分离和直接取子座中心菌块分离，以带回的材料少，仅小量地每隔1个月进行1次，但分离出的菌与康定分离的和子囊孢子分离的都是同一种菌、即使已保存9个月之久的材料分离出的也是如此。这些试验结果表明，从冬虫夏草大规模分离出的分离物90%以上是同一分种生孢子阶段的真菌，同时也表明，这种分生孢子阶段的真菌同冬虫夏草菌的有性阶段、Cordycepssinensis（Berk.）Sacc.有着多么密切的联系。据此，我们按康定产区大量分离所获得的90%以上的菌和远离产区北京实验室组织分离和子囊孢子分离的都是这一种真菌这一事实，初步得出结论：这种分生孢子真菌是冬虫夏草菌的无性阶段。特征和鉴定冬虫夏草菌是一种嗜较低温度的真菌，15°-20℃为其适温，在25℃以上则抑制生长。在试验中将接种体虫体置于盛有胨PDA的培养皿内在20℃温箱中培育，6-7天后方在虫体上长出灰白、继而转变成棕黄乃至黑色、在子座及柄部上则生长出棕黄色至黑褐色的菌苔，但很久不扩展延及于培养基上。为了避免快速生长的杂菌覆盖污染，遂及时将其分别移殖于斜面试管中培育。这样移殖后2星期，始见接种体渐渐变黑而且有的稍膨大，其上有极不发达短而稀疏的菌丝体。2个月后以接种体为中心形成直径6-8mm的圆形黑色菌落并有黑色色素渗入培养基内。3个多月后，斜面上菌落直径才达1.5cm左右。这时，接种体中心里黄褐色，其较宽的周缘呈黑色且表面光滑、有稀疏平贴的纤细菌丝体。一般菌落较坚硬。之后，在中心部分出现极为稀疏的白色菌丛，是冬虫夏草菌的菌丝体和分生孢子。但在某些特殊处理下，也可获得产生较多的菌丝体和分生孢子，特别是在一些特殊培养基上，既可产生高达2-3cm似蚯蚓粪泥状的隆起黄褐色子座组织，也可生长出丰茂白色含分生孢子的菌落。中国被毛孢新种图1HirsutellasinensisLiu,Guo,YuetZeng,sp.nov.SpeciessimilisHirsutellaeguyanae(exlarvaSaccharosydnesaccharivora)etH.verticillioidi(inLeptopharsahevae)quaedifferuntillaconidiophorisinfasciculatis,cellulisconidiogenisrariuspolyphialidicis,conidiislatioribus,haecconidiophorisinfasciculatis,cellulisconidiogenisplerumquepolyphialidicis,conidiisbrevioribus.图1中国被毛孢Fig.1HirsutellasinensisLiu,Guo,YuetZengMycelium(inmedio1%PeptonePDA)laxum,superficiale,raroimmersum,hyalinum,septatum,ramosumlaeve,velverrucusum,2.2-4.3(-5.4)μmlatum.Conidiophorahyalina,solitariavel2-8infasciculo,nonramosavelramosa,veladcellulaeconidiogenaesessilesreducta,terminaliavellateralia,hyphisinvegetabilis,velcellaeconidiogenaeet1-6aliarumcellularumcomposita,velcum2-6cellulisconidiogenisdisposita,laeviavelverrucusa,56.0-103.0×4.8-8.7μm.Cellulaeconidiogenaemonophialides,enteroblasticae,hyalinae,laevesvelverrucusae,aciculariaevelsubuliformiae,erectaevelmagnoperacurvatae,17.3-47.6μmlongae,apicemacutae,1.0-2.0μmlatae,basim3.2-5.4μmlatae.Conidiahyalina,aseptata,laevia,reniformiavellongeellipsoidea,5.4-14.0×3.2-4.3(-5.4)μm,plerumque2-4(-6)inmucoinvoluta,limoniformia,6.5-19.5×4.3-16.2μm.CulturasiccatypiexlarvaHepialisp.isoclata,Huoshaoshan,Kangding,SichuanProvincia,Sinica,V1987,legYuYong-xin,FangLiang-zhenetHuaWei-wei(HMAS55469,Typus).菌丝体（在1%胨PDA上）稀疏发生，表生，较少基生，无色，有隔膜，分枝，平滑或具微疣，宽2.2-4.3（-5.4）μm。分生孢子梗无色，单生或2-8本簇生于无色球形细胞组成的小子座上，不分枝至分枝，但不形成孢梗束，最简单的仅为无柄产孢细胞单生于营养菌丝的顶端或作为侧校几乎呈直角伸出，或为1产孢细胞和1-6个支撑细胞组成，有的还在主梗顶部第1-3隔膜下轮生出产孢细胞或分枝，每隔膜下2-6个，直立或向外强烈弯曲，56.0-103.0×4.8-8.7μm。产孢细胞系瓶形小梗，无色，单点内壁产孢，平滑或具微疣，针形或钻形，长17.3-47.6μm，基宽3.2-5.4μm，逐渐向上尖削成一狭窄的颈部，颈顶宽1.0-2.0μm。分生孢子无色，无隔膜，平滑，肾形或长椭圆形，5.4-14.0×3.2-4.3（-5.4）μm，大多2-4（-6）个一群为一粘被膜所包围。粘被膜柠檬形，6.5-19.5×4.3-16.2μm。中国被毛孢（Hirsutellasinensis）8706-（2）870525（III）菌株系自四川康定火烧山采集的冬虫夏草新鲜质佳的样品分离（俞永信、方良珍、华巍巍1987年5月采）。模式菌株干培养物（HMAS55469）保存于中国科学院微生物研究所真菌标本室。中国被毛孢与Minter和Brady（1980）发表的两个新种、生于同翅目甘蔗长飞虱（Saccharosydnesaccharivora）的圭亚那被毛孢（Hirsutellaguyana）和生于半翅目橡胶树瘦蝽（Leptopharsaheveae）的轮生被毛孢（Hirsutellaverticillioides）相近似，但后两菌的分生孢子梗均不簇生而且较窄（-6μm），支撑细胞少或无（前一菌1-2个，后者则无）；产孢细胞均兼有多点芽茁产孢方式且不呈强烈弯曲；粘被膜均较小（前者8-13，后者6-11μm）；甚至分生孢子的量度上也有差异（前者8-12×3-7，后者6-8×3-5μm）。因而中国被毛孢是一新种。讨论冬虫夏草的人工栽培必须将四个方面的条件完好的解决才能顺利完成。这四个条件是：（1）菌种，（2）繁殖蝙蝠蛾的技术，（3）侵染途径和（4）摹拟产地的生态环境，特别是土壤、土壤和大气的温、湿度和光线。显然，菌种是其中的一个关键性条件。近期以来，各研究机构都各自分离得到了菌种，但由于还在保密阶段，所以有关冬虫夏草菌种的报导较少。沈南英等（1983）曾报道过冬虫夏草菌的分离培养，但迄今未见到该菌种的鉴定结果；同年。小林和清水（1983）在其《冬虫夏草菌图谱》一书中叙述并图示过冬虫夏草培养产生的不完全阶段菌，是无色分生孢子的葡萄穗霉属型（Stachybotrys）；翌年，陈庆涛等（1984）以在康定分离冬虫夏草得到的菌株，发表了中国拟青霉（PaecilomycessinensisChen，XiaoetShi）新种并认为可能是冬虫夏草菌的无性阶段。不过，在我们大量分离中，连同杂菌在内却从未发现过1株葡萄穗霉属的菌。虽然在试验中确有拟青霉属（Paecilomyces）菌的出现，但我们观察到频率极低且发生无规律性，故认为是杂菌。至于陈庆涛等（1984）在同一产区却未能获得同我们分离出的同一种真菌，可能是在