分子发光分析fa.

分子发光分析molecularluminescenceanalysis一、分子发光分析法定义基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光(MolecularLuminescence)。分子发光分析概述通过测量辐射光的强度对被测物质进行定量测定的一类分析方法称为分子发光分析法。二、分子发光的分类分子发光热致发光光致发光场致发光化学发光荧光磷光三、荧光（或磷光）是如何产生的？基态分子激发态荧光磷光光辐射非辐射跃迁一、激发态→基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫无辐射跃迁激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光和磷光分析基本原理S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2内转换振动弛豫非辐射能量传递过程♥振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。♥内转换：同多重度电子能级中，等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。♥外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。♥系间跨越：不同多重态，有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态(多为S1→S0跃迁)，发射波长为l′2的荧光；10-7～10-9s由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长l′2l2l1；磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态(T1→S0跃迁)；l3l′2电子由S0进入T1的可能过程：(S0→T1禁阻跃迁)S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1发光速度很慢：10-4～100s。光照停止后，可持续一段时间。荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长（发射波长）下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱Ilex固定lem荧光波长获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的lem不变，改变第一单色器波长，从200~700nm扫描，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以I为纵坐标，lex为横坐标得左图，即荧光物质的激发光谱。从曲线上找出lex，实际上选波长较长的高波长峰（一）激发光谱Ilem固定lex激发光波长获得方法：先把第一单色器的波长固定，使激发的lex不变，改变第二单色器波长，让不同波长的光扫描，测定它的发光强度，以I为纵坐标，lem为横坐标得左图，即荧光物质的发射光谱。从曲线上找出最大的lem。（二）发射光谱（荧光或磷光光谱）从曲线上找出lem，实际上选强度较强的波长峰从图中看出l磷＞l荧＞l激200260320380440500560620荧光激发光谱荧光发射光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱1.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。2.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图l2,l1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如l'2)。3.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。（2）减弱荧光的取代基——-COOH、-NO2、-COOR、-NO、-SH吸电子基团,使荧光波长短移，荧光强度减弱（3）影响不明显的取代基——-NH3+、-R、-SO3H等芳环上被F、Cl、Br、I取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。供电子基：–NH2、-OH、-NHR、-NR2、-CN→f↑，F↑吸电子基：-NO2、-COOH、-NHCOCH3、-C=O、-NO、-SH、-X→f↓，F↓，甚至荧光熄灭-R、-SO3H、-NH3+→对f无影响联苯f=0.2芴f=1.0OCOO--O酚酞OOCOO--O荧光素钠荧光素：氧桥把两个环固定在一个平面上，具有平面结构，强荧光物质酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很好的共平面，为非荧光物质1，2-二苯乙烯反式：平面构型强荧光体顺式：非平面构型非荧光体C=CHHC=CHH8-羟基喹啉8-羟基喹啉镁NOHNOMg1/2总结强荧光物质的结构特点：（１）→﹡比n→﹡有利φf↑（２）共轭体系φf↑（３）刚性平面结构φf↑（４）取代基影响◆给电子基团φf↑◆吸电子基团φf↓(φp↑)◆取代基位置:邻、对φf↑◆重原子取代基φf↓(φp↑)1.溶剂的影响同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，荧光强度增大2.温度的影响——低温下测定，提高灵敏度因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。温度对磷光影响更大大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液pH的影响很大OHO_OHH+_苯酚离子化后，荧光消失pH≈1有荧光pH≈13无荧光•共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长4.荧光猝灭——荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降或荧光效率f下降称为荧光猝灭。使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂•碰撞猝灭——M+l激→M*M*+Q→M+Q+热•自熄灭——荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象5.各种散射光的影响瑞利散射和拉曼散射随激发光波长的改变而发生改变，而荧光波长与激发光波长无关，因此可通过改变激发光的波长就可能避免散射光的干扰。6.激发光散射的影响光分解作用可引起荧光强度的急剧降低。五、荧光定量分析基础If=fIa=f(Io-I)If:荧光强度Io:所吸收的辐射强度；f：荧光效率AoIIIIA10lg01.荧光强度与浓度的关系]3)3.2(2)3.2(3.2[)101(32AAAIIIIoffAoff将指数展开：如果吸光度A0.05,方括号中其他各项与第一项相比均可忽略：AIIoff3.2fI0bKcbcIIoff3.2由于A=bc：故在实验条件固定时，荧光强度与浓度成正比，即：bIKof3.2荧光强度与物质浓度呈线形关系，If=KC只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或痕量组分，灵敏度高。浓度高时，If与C不呈线形关系，有时C增大，If反而降低因为公式[]中后面影响，有时发生荧光猝灭效应。2.定量分析方法定量分析依据If=KCIp=KC(1)标准曲线法——最常用的定量分析方法将已知量的标准物质与试样在相同条件下处理，配制一系列标准液，测定它们的相对发光强度。以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标浓度C1C2C3C4C5Cx荧光强度If1If2If3If4If5IfxIfIfxCxC如果试样数量不多，可用比较法进行测量配一标准溶液浓度为Cs，Cs与未知液浓度Cx相近，并在相同条件下测定它们的荧光强度未知液Ifx=KCx标准液Ifs=KCs比较CsCxIIfsfx00ffsffxfsfxIIIICsIICsCx荧光强度减去空白后若有试剂空白，测得的六、荧光定性分析比较法——最常用的荧光定性方法在相同的分析条件下，将待测物的荧光发射光谱与预期化合物的荧光发射光谱比较，如果发射光谱的特征峰波长及形态一致，则认为可能为该物质。如果两物质的荧光发射光谱非常相似，而激发光谱有较大差别，因此以激发光谱结合发射光谱鉴定可提高定性结果的可信度。一、荧光分光光度计——主要由光源、单色器、液池、检测器和显示器组成与分光光度计有两点不同①两个单色器②检测器与激发光互成直角光源激发单色器液池检测器发射单色器检测器放大器及记录器lemI0Ilex光源第一单色器样品池第二单色器光电管显示器荧光分光光度计的框架图由光源发射的光经第一单色器得到所需的激发光波长，通过样品池后，一部分光能被荧光物质所吸收，荧光物质被激发后，发射荧光。荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱大多数荧光分光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长lex，用此激发光激发液池内的荧光物质lex第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长lem。在选定的lem下测定荧光强度，定量分析4.检测器•把光信号转化成电信号，放大，直接转成荧光强度•荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管•荧光分析比吸光光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可大大提高荧光强度与荧光分析仪器相似，主要差异如下：1.试样室试样需在液氮温度（77K，-196℃）下测定低温磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内）固体表面室温磷光分析需特制试样室2.磷光镜有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用机械切光装置——磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。§12-4荧光分析法和磷光分析法的特点与应用一、荧光分析法的应用3，4-苯并芘为强致癌物质煤炭、石油、天然气等燃料不完全燃烧以及吸烟、焚烧垃圾都会产生3，4-苯并芘，汽车尾气也是主要来源食品加工过程也会产生3，4-苯并芘，尤其是烟熏、油炸、烘烤食品分析测定：用环己烷将3，4-苯并芘从试样中提取出来，用碱将提取液的脂肪类物质皂化，然后用色谱法分离纯化，用95%C2H5OH稀释，用荧光分光光度计测定相对荧光强度进行定量——又称核黄素，是一种生长促进剂，常存在于动物肝脏、肉类、蛋黄、豆类、花生、蘑菇和海藻中，VB2易溶于强酸或强碱性溶液。在低浓度情况下，I=KC，I与C呈线性关系，在pH6~7荧光最强在430~440nm蓝光照射下，发出绿色荧光，lem=535nm下测I，用标准曲线法测定CHHOHOHONNNNHCHCHCHOHCH22OOHCHC33缺VB2会得口角炎、舌炎、唇炎、脂溢性皮炎维生素B2激光荧光分析时间分辨荧光分析(time-resolvedfluorometry)同步荧光分析胶束增敏荧光分析能产生磷光的物质数量很少，磷光分析不及荧光分析普遍，但磷光分析法已在药物分析、临床及环境分析领域得到一定的应用。•低温磷光分析已应用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多环芳烃及含O、S、N的杂环化合物分析•固体表面室温磷光分析法已成为多环芳烃和杂环化合物的快速、灵敏的分析手段。三、荧光和磷光分析法的特点1.灵敏度高，取样量少2.选择性好，测量简单缺点：本身能发荧光和磷光的物质不多，增强荧光的方法有限优点：总结1.痕量分析荧光猝灭法、荧光探针2.联用技术的检测器与HPLC联用3.分子结构性能测定为分子结构及分子间相互作用的研究提供有用的信息一、概述化学发光是建立在化学发光现象基础上的分析方法•化学发光与荧光的主要区别：受激发时所需的能量来源不同，需要化学反应过程中所提供的化学能化学发光的机理：当某些物质在进行化学反应时，吸收了反应时产生的化学能，使反应产物分子激发至激发态，再由第一激发态的最低振动能级回到基态的各振动能级时，产生光辐射或将能量转移到另一种分子而发射光子。发光反应必须满足以下条件：1.化学反应必须产生足够的化学能化学发光基于化学反应提供足够的能量A+B→C*+D产物接受反应能被激发C*→C+h•在可见光区观察化学发光，需150~4