分子标记辅助选择

第十七章分子标记辅助选择育种传统的育种主要依赖于植株的表现型选择(Phenotypiealselection)。环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。例如抗病性的鉴定就受发病的条件、植株生理状况、评价标准等影响；品质、产量等数量性状的选择、鉴定工作更困难。一个优良品种的培育往往需花费7～8年甚至十几年时间。如何提高选择效率，是育种工作的关键。育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选择效率与育种预见性。遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记。棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻的紫色叶鞘等形态性状标记，在育种工作中曾得到一定的应用。以非整倍体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的细胞学标记，在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外缘基因鉴定中起到重要的作用，但许多作物难以获得这类标记。生化标记主要是利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型差异。它们在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用。但是它们多态性低，且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响，难以满足遗传育种工作需要。以DNA多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其是分子标记辅助选择(molecularmarker-as—sistedselection，MAS)育种更受到人们的重视。第一节分子标记的类型和作用原理一、分子标记的类型和特点按技术特性，分子标记可分为三大类。第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restrictionfragmentlengthpolymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术。PCR是Mullis等(1985)首创的在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促反应，合成特异DNA片段的一种方法。PCR技术的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。PCR反应分变性(denaturation)、复性(annealling)、延伸(exten—sion)三步(图17—1)。变性指的是通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA的过程；复性(又称退火)是指当温度降低时，单链DNA回复形成双链的过程，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA大大高于模板DNA，容易使引物和其互补的模板在局部形成杂交链；延伸是指在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，在聚合酶催化下进行以引物为起始点的5'-3'的DNA链延伸。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，经25～30个循环后，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量的复制，数量可达2×106-7拷贝。按照PCR所需引物类型又可分为：①单引物PCR标记，其多态性来源于单个随机引物作用下扩增产物长度或序列的变异，包括随机扩增多态性DNA标记(Random别amplificationpolymorphismDNA，RAPD)、简单重复序列中间区域标记(1nter-simplesequencerepeatspolymorphisms，ISSR)等技术；②双引物选择性扩增的PCR标记，主要通过引物3'端碱基的变化获得多态性，这种标记主要指扩增片段长度多态性标记(Amplifiedfragmentlengthpolymorphisms，AFLP)；③需要通过克隆、测序来构建特殊双引物的PCR标记如简单序列重复标记(Simplesequencerepeats，SSR)、序列特征化扩增区域(Segion，简称SCAR技术)和序标位(Sequence—taggedsites，简称STS)等。第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失等。表达序列标签(Expressedsequencestags，EST)是在cDNA文库中随机挑选克隆，并进行单边测序(Singlepasssequence)而产生的300～500bp的核苷酸片段。应用于分子标记辅助育种的标记主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP、STS等。它们的遗传、表现特点总结于表17—1。分子标记是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点：①表现稳定，多态性直接以DNA形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；②数量多，理论上遍及整个基因组；③多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；④对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；⑤部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；⑥成本不是太高，一般实验室均可进行。对于特定探针或引物可引进或根据发表的特定序列自行合成。二、分子标记的原理和遗传特性(一)RFLP发现最早，目前应用最为广泛的一种分子标记。这一类标记在20世纪70年代已被发现。1980年，人类首先将其用于构建连锁图。目前，该技术已广泛用于动植物连锁图的构建、重要农艺性状基因的分子标记等。1．RFLP标记的原理植物基因组DNA上的碱基替换、插人、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶(restrictionenzymes，简称RE)酶切位点的增加或丧失是产生限制性片段长度多态性的原因。对每一个DNA／RE组合而言，所产生的片段是特异性的，它可作为某一DNA所特有的“指纹”。某一生物基因组DNA经限制性内切酶消化后，能产生数百万条DNA片段，通过琼脂糖电泳可将这些片段按大小顺序分离，然后将它们按原来的顺序和位置转移至易于操作的尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用放射性同位素(如32P)或非放射性物质(如生物素、地高辛等)标记的DNA作为探针，与膜上的DNA进行杂交(即Southern杂交)，若某一位置上的DNA酶切片段与探针序列相似，或者说同源程度较高，则标记好的探针就结合在这个位置上。放射自显影或酶学检测后，即可显示出不同材料对该探针的限制性片段多态性情况(图17—2)。对于线粒体和叶绿体等相对较小的DNA分子，通过合适的限制性内切酶酶切，电泳分析后有可能直接检测出DNA片段的差异，就不需Southern杂交。RFLP分析的探针，必须是单拷贝或寡拷贝的，否则，杂交结果不能显示清晰可辨的带型，表现为弥散状，不易进行观察分析。RFLP探针主要有三种来源，即cDNA克隆、植物基因组克隆(RandomGenome克隆，简称RG克隆)和PCR克隆。2．RFLP标记的特点RFLP标记具有共显性的特点。共显性(co-dominant)标记指的是双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在F，中表现。它已被广泛用于多种生物的遗传分析，特别是构建植物遗传图谱。RFLP标记所需DNA量大(5～15鹏)，检测步骤繁琐，需要的仪器、设备较多，周期长，检测少数几个探针时成本较高，用作探针的DNA克隆其制备与存放较麻烦；检测中要利用放射性同位素(通常为少')，易造成污染。尽管非放射性物质标记方法可用，但价格高，杂交信号相对较弱，灵敏度也较同位素标记低。目前，RFLP标记直接用于育种成本高，人们正致力于将RFLP标记转化为PCR标记，便于育种上利用。(二)RAPD标记1．RAPD标记的原理Williams等(1990)以DNA聚合酶链式反应为基础而提出的。所谓RAPD标记是用随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物(长度为10个核苷酸)通过PCR扩增染色体组中的DNA所获得的长度不同的多态性DNA片段。RAPD标记的原理同PCR技术，但又有别于常规的PCR反应。主要表现在以下3个方面：·①引物。常规的PCR反应所用的是一对引物，长度通常为20bp(碱基对)左右；RAPD所用的引物为一个，长度仅10bp。②反应条件。常规的PCR复性温度较高，一般为55—60℃，而RAPD的复性温度仅为36℃左右。③扩增产物。常规PCR产物为特异扩增，而RAPD产物为随机扩增。这样，RAPD反应在最初反应周期中，由于短的随机单引物，低的退火温度，一方面保证了核苷酸引物与模板的稳定配对，另一方面因引物中碱基的随机排列而又允许适当的错配，从而扩大引物在基因组DNA中配对的随机性，提高了基因组DNA分析的效率。原理上与RAPD相似的还有AP—PCR(Arbitrarilyprimedpolymeraechainreaction)。AP—PCR指在PCR反应中使用的引物长度与一般PCR反应中的引物相当，但在反应开始阶段退火温度较低，允许大量错配，因此可引发随机的扩增。一般在AP—PCR反应中应用放射性标记，其产物在聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后通过放射自显影，检测其多态性。2．RAPD标记的特点如果基因组在特定引物结合区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致特定引物结合位点分布发生相应变化，导致PCR产物增加、缺少或分子量大小的变化。若PCR产物增加或缺少，则产生显性的RAPD标记；若PCR产物发生分子量变化则产生共显性的RAPD标记，通过电泳分析即可检测出基因组DNA在这些区域的多态性。RAPD标记一般表现为显性遗传，极少数表现为共显性遗传。显性标记指的是F1的多态性片段与亲本之一完全一样，这样在杂交组合后代中扩增产物的记录可记为“有／无”，即把每一随机扩增多态性片段作为分子图谱的一个位点。RAPD引物长一般为10个碱基，人工合成成本低，一套引物可用于不同作物，建立一套不同作物标准指纹图谱。RAPD可以方便用于种质资源指纹档案建立，种内遗传多样性分析和品种纯度鉴定。因此RAPD也是一种潜力很大的分子标记。由于使用DNA扩增仪，操作自动化程度高，分析量大，且免去了RFLP中的探针制备、同位素标记、Southern印迹等步骤，分析速度很快。RAPD分析所需DNA样品量少(一般5～10ng)，对DNA质量要求较RFLP低。同时，RAPD标记还可转化为RFLP探针，SCAR及STS等表现为共显性和显性的分子标记。RAPD最大缺点是重复性较差。RAPD标记的实验条件摸索和引物的选择是十分关键而艰巨的工作。为此研究人员应对不同物种做大量的探索工作，以确定每一物种的最佳反应程序包括模板DNA、引物、Mg2+浓度等。只要实验条件标准化，可以提高RAPD标记的再现性。3．SCAR标记在RAPD技术的基础上，1993年，Paran等提出了一种将RAPD标记转化成特异序列扩增区域标记，即SCAR标记。它的基本原理是：目标DNA经RAPD分析后，将RAPD多态片段克隆一对克隆片段两端测序一根据测序结果设计长为18～24bp的引物，一般引物前10个碱基应包括原来的RAPD扩增所用的引物。多态性片段克隆之前首先应从凝胶上回收该片段，由于Taq酶可使PCR产物3，末端带上A尾巴，人工设计的克隆载体5，末端有一个突出的T碱基，这样可使PCR产物高效地克隆到载体上。将连接产物转化大肠杆菌，涂平板，挑选重组克隆，测序分析、设计引物，PCR扩增，检测是否还能扩增出原来的多态性条带。这种转化成功的标记就称为SCAR标记。由于SCAR标记所用引物长，特异性扩增重复性好，可有效的用于分子育种。(三)AFLP它是荷兰Keygene公司科学家Marc＆Pieterl993年创造发明的一种DNA分子标记。该技术是对限制性酶切片段的选择性扩增，又称基于PCR的RFLP。鉴于AFLP标记的多态性强，一次可检测到100—150个扩增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及遗传多样性的研究。1．AFLP标记的原理首先对基因组的DNA进行双酶切，其中一种为酶切频率较高的限制性内切酶(frequentcutter)，另一种为酶切频率较低的酶(rarec