分子生物学习题

1、典型的DNA重组实验通常包括那些步骤？a、提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶接连接到另一DNA分子上（克隆载体），形成一个新的重组DNA分子。b、将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化。c、对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定。d、对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表达。A目的基因的获得：通过一定的方法得到需要进行操作的目的DNA，常用的方法有：化学合成法，基因文库法和cDNA文库法B目的基因与载体分子在体外进行连接反应，形成重组体：通过限制性内切酶对含目标片段的DNA和载体进行切割后，通过DNA连接酶进行连接，完成基因的重组过程。5、试述RNAi技术的原理及应用？原理：近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。应用：RNAi的分子机制通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititationandeffectorsteps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(smallinterferingRNAs,siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.二、综述题目试结合自己的研究方向，试述分子生物学的发展在本研究领域的应用！基因芯片技术的应用4.3.1测序4.3.2发现与疾病相关的新基因寻找和疾病相关的基因可以从分子水平研究疾病的病因和发生机理。Wang等在研究表鬼臼毒素吡喃葡糖苷诱导的细胞程序性死亡时，利用DNA芯片技术，制备了一次可检测6591种人细胞mRNA的寡聚核苷酸微阵列，检测到诱导后细胞内有62种mRNA的量发生了变化。通过挑选12个与诱导作用有关的基因作进一步研究，发现了2个新的p53靶基因；该法比传统检测法灵敏度高，可检测低浓度表达水平的mRNA。4.3.3基因表达分析从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱可以得出病变的DNA信息。基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，成为一项现代化诊断新技术。例如，Affymetrix公司把p53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成p53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用；又如，Heller等构建了96个基因的cDNA微阵列，用于检测分析风湿性关节炎相关的基因，以探讨DNA芯片在感染性疾病诊断方面的应用。现在，肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。基因诊断是基因芯片中最具有商业化价值的应用。4.3.4药物的研究与开发如何分离和鉴定药物的有效成分是目前中药产业和传统西药开发遇到的重大障碍，基因芯片技术是解决这一障碍的有效手段，它能够大规模地筛选，通过性强，能够从基因水平解释药物的作用机理，即可以利用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异。如果再用mRNA构建cDNA表达文库，然后用得到的肽库制作肽芯片，则可以从众多的药物成分中筛选出起作用的部分物质。或者利用RNA、单链DNA有很大的柔性，能形成复杂的空间结构，更有利与靶分子相结合，可将核酸库中的RNA或单链DNA固定在芯片上，然后与靶蛋白孵育，形成蛋白质—RNA或蛋白质—DNA复合物，可以筛选特异的药物蛋白或核酸，因此用基因芯片作大规模的药物筛选研究可以省略大量的动物试验，缩短药物筛选所用的时间，而且cDNA芯片能被用于检测啮齿动物或人类的目标或非目标组织中的毒性反应，得到最佳的治疗指标的药物剂量，能用这种促进主要化合物发展最优化的检测方法来确定。从而帮助确定对治疗有反应或抑制药物不利影响的敏感个体。目前国外很多制药公司已开始建立表达数据库，为药物筛选提供各种靶基因及分析手段。此外，基因芯片技术还可以用于治疗，例如，已开发出在4mm的芯片上满布400根有药物的针，定时定量为病人进行药物注射。制作定时释放胰岛素治疗糖尿病的生物微泵及可以置入心脏的芯片起搏器等。6、描述一件你认为有影响的2007年生物科学领域的大事件加以评论。持家基因(house-keepinggenes)：又称管家基因，是指所有细胞中均要表达的一类基因,其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。细菌转化：指某一受体细菌通过直接吸收来自另一供体细菌的含有特定基因的脱氧核糖核酸（DNA）片段，从而获得了供体细菌的相应遗传性状，这种现象称为细菌转化特许因子(Licensingfactor)：对于DNA复制的起始是必须的，复制后开始失去活性，不能通过核膜进核，只有在有丝分裂核膜解体时进核，严格控制每次细胞周期只进行一次DNA复制的因子。（一种蛋白，当核膜溶解时进入细胞，用一次即失活，防止未成熟细胞在分裂。）端粒酶（Telomerase），是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，端粒酶能延长缩短的端粒（缩短的端粒其细胞复制能力受限），从而增强体外细胞的增殖能力。端粒酶在正常人体组织中的活性被抑制，在肿瘤中被重新激活，端粒酶可能参与恶性转化。端粒酶在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用。端粒（telomeres）:染色体末端的DNA重复序列。外显子（exon）和内含子(intron)：外显子是指真核细胞的基因在表达过程中能编码蛋白质的核苷酸序列。它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。是最后出现在成熟RNA中的基因序列,又称表达序列。内含子是基因内的间隔序列，不出现在成熟的RNA分子中，在转录后通过加工被切除。大多数真核生物的基因都有内含子。同裂酶（isoschizomer）：一类来源于不同但识别位点和切割位点均相同的酶。同尾酶（isocaudamer）:来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后产生相同的粘性末端的一类酶。组成性表达（constitutiveexpression）：较少受环境因素的影响，在个体各个生长阶段的几乎全部组织中持续表达或变化很小这类基因的表达方式。基因表达(geneexpression)是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子.生物体内的各种功能蛋白质和酶都是同相应的结构基因编码的。