分子生物学讨论课

分子生物学第二次讨论苏颖慧2201150918刘祎阳2201150919李磊2201150920周泽2201150927蛋白质双向电泳的原理、方法及应用2DNA测序在医学中的应用4DNA测序的原理与发展3WesternBlot的原理、方法及应用1目录①WesternBlot的原理、方法及应用WesternBlot的原理1.什么是Westernblot◎印迹法（blotting）：是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。◎蛋白免疫印迹(WesternBlot)：是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。◎细胞内基因表达的最终产物是蛋白质，因此检测蛋白质是研究基因表达最常用、最有效的手段之一。2.基本原理经过PAEG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。WesternBlot的原理直接法间接法标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。所以一般情况下都釆用间接法进行检测。WesternBlot的原理WesternBlot的操作流程样品制备电泳转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色蛋白质样品制备1.水溶液提取法2.有机溶剂提取法3.层析或电洗脱法电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳：（1）清洗玻璃板（2）灌胶与上样（3）电泳（4）转膜缓冲液中浸泡凝胶转膜1.膜的选择：硝酸纤维素膜（CN）2.操作方法：半干法WesternBlot的操作流程WesternBlot的操作流程封闭一抗杂交二抗杂交1.目的：降低抗体与膜的非特异性结合2.漂洗：去离子水与PBST或TTBS3.封闭：浸没于封闭液中，4摄氏度缓慢摇荡过夜1.根据一抗来源选择合适的二抗（生物素连接的羊抗鼠），室温下一小时。2.漂洗：洗去游离的二抗1.鼠抗人按1:1000比例稀释于20ml抗体稀释液中。2.加于膜上，室温下1-2h。3.漂洗：洗去游离的一抗WesternBlot的操作流程底物显色原理：辣根过氧化物酶在碱性条件下催化Luminol氧化，同时释放出光子，产生的光信号可用X射线片直接记录下来。加入Avidin（抗生物素蛋白）-生物素化辣根过氧化物酶（HRP）30-60min洗去游离的HRP用ECL化学发光剂进行信号检测WesternBlot的操作流程WesternBlot的操作流程WesternBlot的应用1.目的蛋白的表达特性分析2.目的蛋白与其他蛋白的互相作用3.目的蛋白的组织定位4.目的蛋白的表达量分析1.WesternBlot法诊断囊虫病2.应用荧光定量PCR和WesternBlot检测RNA干扰肺腺癌A549细胞STAT3基因表达水平4.WesternBlot法测定风疹病毒特异性抗原1.WesternBlot法诊断囊虫病囊虫病是由猪带绦虫幼虫即囊尾蚴寄生于人体引起的人兽共患寄生虫病WesternBlot的应用•免疫学实验对本病诊断有重要作用，但目前用各种方法纯化的抗原其敏感性、特异性均不理想。•运用DNA重组技术，构建来源于猪囊尾蚴的cDNA表达文库，以囊虫病患者及病猪血清为抗体，从中筛选出4个特异性抗原（cC1、cC2、cP1、cH1）。这些抗原克隆经IPTG诱导，形成β-半乳糖苷酶-猪囊尾蚴特异性抗原的融合蛋白。•采用简化Westernblot法，以等比混合的四种融合蛋白为抗原测囊虫病、华支睾吸虫病、包虫病患者血清中的相应抗体1.WesternBlot法诊断囊虫病WesternBlot的应用•Western印迹分析检测STAT3表达•荧光定量PCR检测STAT3mRNA的表达2.应用荧光定量PCR和Westernblot检测RNA干扰肺腺癌A549细胞STAT3基因表达水平WesternBlot的应用3.WesternBlot法测定风疹病毒特异性抗原•风疹病毒能够引起先天感染。通过孕妇传播，致使胎儿先天畸形或导致先天性风疹综合症，如：先天性心脏病、智力低下等•能够早期快速诊断对于优生优育、提高人口素质、预防后天及再感染具有重要意义。WesternBlot的应用可采用WesternBlot的方法，测定风疹病毒的主要抗原性蛋白，以指导临床应用。目前临床上所用的ELISA检测试剂盒所包被抗原为全细胞粗制抗原，特异度低、灵敏度差、缺乏统一的抗原标准。WesternBlot的应用②蛋白质双向电泳的原理、方法及应用第一向：等电聚焦（等电点不同）第二向：SDS--聚丙烯酰胺凝胶电泳（亚基分子量大小不同）原理双向电泳(two-dimensionalelectrophoresis)是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳(按照pI分离)，然后再进行SDS-PAGE(按照分子大小)，经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。等电聚焦电泳SDS-PAGE电泳•特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳•特点是在凝胶中加入一种两性电解质载体，从而使凝胶在电场中形成连续的pH梯度•蛋白质聚集的部位蛋白质所带电荷为零•SDS-PAGE主要用于测定蛋白质亚基分子量•SDS能断裂分子内与分子间的氢键•强还原剂能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂•解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合后形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量•蛋白质的分子量在15000~200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。原理双向电泳（2DE）示意图提取的总蛋白溶液等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离SDS-PAGE分离，使得蛋白质按分子量大小排序分子量大小原理硝酸银染色图谱考马斯亮蓝染色图谱2DE图谱原理原理双向电泳（DIGE）示意图样品1：Cy3标记样品2：Cy5标记将标记的样品混合双向电泳分离荧光扫描仪扫描图像重叠分析DIGE图谱原理•取叶片200mg加少许石英砂于液氮中研成粉末悬浮于3ml可溶性蛋白抽提液中，4℃放置1小时以上；•4℃，15000r/min条件离心15min，取上清液按1:4与冷丙酮混合，-20℃放置3小时以上或过夜；•15000r/min条件离心15min，取沉淀，用80%丙酮洗两次；•15000r/min条件离心15min，真空干燥溶于400ul混合液中；•15000r/min条件离心15min，取上清上样。叶片可溶性蛋白质的制备方法•（1）玻管的准备：取内径1.5～2mm，长16cm玻管，用乙醇:盐酸为6:4的溶液浸泡30min再用蒸馏水冲洗，烘干。灌胶前用封口膜封住管的一端，固定。•（2）凝胶的配制与等电聚焦：取尿素2.06g，加入0.75ml蒸馏水，0.75ml10%的NP-40，37℃水浴，待尿素充分溶解后加入0.5ml的凝胶原液和两性电解质0.05mlpH3.5～10、0.05mlpH4～6、0.15mlpH6～8，再加入10μl10%lAP和3μlTEMED，混匀后灌胶。在灌好的胶管的顶部覆盖1cm的双蒸水，室温聚合1小时以上，待胶聚合好后吸去上层水溶液加样30μl，再加入20μl样品覆盖液和50mmol/LNaOH至管口，待电泳。第一向等电聚焦电泳方法•聚焦结束后，取出玻管，吸去两端的溶液并以双蒸水清洗，然后用10ml注射器套上200μl的tip头吸取一些水从进样的一端轻轻将胶条打出；•将要测定的胶条按每段1cm分成若干段后，按顺序装入盛有脱气的双蒸水的小瓶中，放4℃冰箱过夜，次日用pH计分别测定各段的pH值；•对要进行第二向SDS-PAGE的胶条则必须放入平衡液[60mmol/LTris-ClpH6.8，2%SDS，5%2-巯基乙醇，10%甘油，0.05%溴酚蓝]中平衡10～30min（平衡后的胶条酸端染成淡绿色而碱端染成深蓝色）；•暂不进行第二向电泳的胶条可放入-20℃保存数日。取胶、pH梯度的测定及胶条的平衡方法•选用DDY-Ⅲ28D型电泳槽，分离胶浓度13%，浓缩胶浓度5%，分离胶长160mm，浓缩胶长40mm（灌至玻板上沿），灌好浓缩胶后在一端插入单孔梳，以便加入蛋白质分子量标准品。•待胶聚合后，将第一向平衡好的胶条平放于浓缩胶顶部（避免胶条拉伸）并用1%琼脂糖（用电极缓冲液配制）封胶。此时应注意避免胶条与浓缩胶上沿之间产生气泡。•待琼脂糖凝固后拔出单孔梳，加入适量按变性胶处理过的marker，加满电极缓冲液，4℃冰箱电泳，恒压200V，至溴酚蓝达胶底部为止（约5h）第二向SDS-PAGE方法染色与脱色电泳结束后，剥下胶板，放入染色液中于室温2h，换脱色液，脱色至背景清晰。（温度升高，染色或脱色速度相对加快）。脱色好后的胶最好立即照相，也可放入7%乙酸于4℃冰箱保存随时照相。{染色液：0.05%考马斯亮蓝R-250，50%甲醇，10%甲酸40%水}{脱色液：慢脱色液：7%乙酸；快脱色液：30%乙醇，10%乙酸}方法321.1直肠癌直肠癌的发生是一个多基因突变导致抑癌基因失活、原癌基因活化的过程。研究发现在相对分子质量为13000和等电点（PI）值为5.6处的蛋白质仅出现在结肠癌的组织中。1.人类疾病的蛋白质组研究应用1.人类疾病的蛋白质组研究1.2肝癌用N.甲基.N.亚硝基脲诱导的小鼠肝癌中，用2.DE及氨基酸微型测序可分辩出肝癌诱导的醛糖还原酶样的蛋白质，此种蛋白质在肝癌、胎肝中有高表达。应用2.新抗生素作用机制的研究新抗生素作用机制的研究方面，2-DE技术发挥了重要作用。因现在细菌对大多数抗生素都有了抗药性，而用于临床的抗生素几乎都是原有抗生素的衍生物。在研究抑制核糖体类抗生素对细菌的作用机制时，对12种作用于翻译过程不同阶段和核糖体内不同分子的抗生素加以考察，发现了其中8种诱导冷休克反应的一系列蛋白质及另4种诱导一系列热休克反应的蛋白质，因此预计新的作用于核糖体的化合物也是诱导这两种反应，并且藉此可推测大肠杆菌对冷热休克的反应发生于核糖体水平上。从而也许可以从全新的角度去开发不会产生抗药性的抗生素应用③DNA测序的原理与发展DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列•DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。测序技术能够真实地反映DNA上的遗传信息，在生命科学研究中扮演了十分重要的角色。•自从1977年第一代测序技术问世以来，经过三十几年的努力，DNA测序技术已经取得了很大的发展，在第一代和第二代测序技术的基础上，以单分子测序为特点的第三代测序技术已经诞生。第一代测序技术1954年，Whitfeld等提出了测定多聚核糖核苷酸链的降解法1977年，Sanger等提出了经典的双脱氧核苷酸末端终止测序法1977年，Gilbert等提出了化学降解法80年代中期，在双脱氧末端终止法的基础上，出现了以荧光标记代替放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射性自显影的自动测序仪90年代中期，出现的毛细管电泳技术使得测序的通量大为提高。这一时期还出现了一些其他的测序方法，如焦磷酸测序法、连接酶测序法、杂交测序法等。DNA测序的发展第二代测序技术Roche公司的454测序技术特点：读长较长(400-600bp)，通量较低(400-600Mb)，相对成本较高主要应用：denovo测序Illumina公司的Solexa技术特点：读长较短(100-150bp),通量高主要应用：RNA测序，表观遗传学研究ABI公司的SOLiD技术特点：读长较短(50-75bp),精度高,通量高主要应用：基因组重测序，SNP检测DNA测序的发展准确度高成本低速度快第三代测序技术Helicos公司的Heliscope单分子测序仪PacificBiosciences公司的SMRT技术OxfordNanoporeTechnologies公司纳米孔单分子技术DNA测序的