分子生物学转录及其调控.

遗传信息由DNA转换到RNA的过程。蛋白质生物合成的第一步，合成mRNA以及非编码RNA（tRNA、rRNA等）多核苷酸链的合成都是以5’→3’的方向.转录特点：（1）对于一个基因组来说，转录只发生在一部分基因，而且每个基因的转录都受到相对独立的控制（2）转录是不对称的(3）转录时不需要引物，而且RNA链的合成是连续的。一、所需因素1.转录模板DNA模板：指导RNA合成的一股DNA链称为模板链（templatestrand），与之相对的另一股链为编码链（codingstrand）.2.RNA聚合酶（RNApolymerase）RNA聚合酶有以下特点：（1）无需引物的存在能独自起始新RNA链的合成（2）没有校对能力；（3）催化的底物是核糖核苷三磷酸。大肠杆菌只有一种RNA聚合酶，负责所有rRNA、mRNA和tRNA的合成。该酶具有全能性，基本上不需要其他蛋白因子的参与，即可独立的进行。功能：（1）识别DNA双链上的启动子（2）通过阅读启动子序列，确定转录方向和模板链（3）解开DNA部分双螺旋，产生约17bp的单链DNA模板（4）选择正确的核糖核苷三磷酸（rNTP）底物并催化形成磷酸二酯键，使合成的RNA链不断延伸。（5）最后当它达到终止子时，识别转录终止信号，停止转录。结构：5种亚基组成：两个α亚基、1个β亚基、1个β′亚基和1个δ亚基。转录的起始阶段：δ亚基和核心酶（α2ββ′）组装成全酶共同起作用。δ亚基无催化活性，但它能识别启动子并将封闭的启动子复合物转换成开放状态。一旦转录起始，δ亚基就从全酶上脱离下来。核心酶与模板DNA结合的亲和力弱，特异性差，这有利于它在模板链上移动，促进转录延伸。σ因子负责识别启动子的保守序列，不同的σ因子识别不同的启动子。许多细菌能产生多种可取代的σ因子，以识别不同的启动子。大肠杆菌只有一种RNA聚合酶，负责所有rRNA、mRNA和tRNA的合成。并且该酶具有全能性，基本上不需要其他蛋白因子的参与，即可独立的进行转录的起始、延伸和终止。一些抗生素，如利链菌素，可以抑制原核生物的RNA聚合酶，使得原核生物的基因无法转录成mRNA，从而达到杀死细菌等原核生物的效果。1.转录起始1）全酶与模板的DNA接触，生成非专一的，不稳定的复合物在模板上移动。2.起始识别：全酶与-35序列结合，产生封闭的酶-启动子二元复合物。3.全酶紧密地结合在-10序列处，DNA模板局部变性，形成开放的启动子二元复合物。（RNA聚合酶与启动子结合后造成约10bp的DNA解链）4.合成短多聚核苷酸（10nt),三元复合物形成。（酶-启动子-NTP）5.σ因子从全酶中解离下来，聚合酶转变为延长构型。酶分子与启动子特异性结合性的结合力下降，延伸阶段开始。终止序列和释放因子终止子：提供终止信号的序列。分为两类：不依赖ρ因子而实现终止作用。依赖ρ因子才能实现终止作用。ρ因子---蛋白质辅助因子不依赖ρ因子终止作用：在转录终止点之前有一段回文序列，回文序列的两个重复部分之间由几个碱基对的不重复阶段隔开依赖于ρ因子终止作用ρ因子是55KDa蛋白，其活性形式为六聚体1）促进转录终止活性2）NTPase活性，需要RNA链。转录单元是一段被转录成单链RNA的DNA序列，它起始于启动子，结束于终止子。一个转录单元可能包含不止一个基因。一、所需因素转录起始需要启动子，RNA聚合酶和转录因子参与。1.转录起始前的上游区具有启动子核心序列。不同物种、不同细胞或不同的基因转录起始点上游有不同的DNA序列，统称为順式作用元件（cis-actingelement).順式作用元件包括启动子、启动子上游元件等近端调控元件和增强子等远隔序列。起始点上游多数有共同的TATA序列，称为TATA盒。（启动子核心序列）启动子上游元件是位于TATA盒上游的DNA序列，多在转录起始点约-40~-100nt的位置，常见的是GC盒和CAAT盒。增强子-能够结合特异基因调节蛋白，促进邻近或远隔特定基因表达的DNA序列。结构基因順式作用元件真核生物转录起始十分复杂，往往需要多种蛋白因子的协助。能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，已发现数百种。统称为反式作用因子（trans-actingfactors)反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的称为转录因子（transcriptionalfactors,TF).真核生物RNA聚合酶不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子，形成转录起始复合物（pre-initiationcomplex,PIC).第一类为普遍转录因子它们与RNA聚合酶Ⅱ共同组成转录起始复合物，转录才能在正确的位置开始。TFⅡD,TFⅡA，TFⅡF，TFⅡE，TFⅡH等，它们在转录起始复合物组装的不同阶段起作用。第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子，这此TF是在特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素，生长因子或其它刺激后，开始表达某些特异蛋白质分子时，才需要的一类转录因子。内部启动子的起始各阶段，涉及三个起始因子1.原核生物聚合酶仅有一种，有多个亚基。真核生物有三种DNA依赖性RNA聚合酶，有两个不同的大亚基和十几个不同的小亚基。2.原核生物RNA聚合酶可直接结合DNA模板，而真核生物RNA聚合酶与辅助因子结合后才结合模板。3.转录起始：原核生物RNA聚合酶要结合到DNA模板上，DNA双链局部打开，使其中一条链作为转录模板。真核生物转录起始前的上游区段具有启动子核心序列，RNA聚合酶不能直接结合模板，RNA聚合酶II启动转录时需要转录因子才能形成转录复合物。当合成一段含有60-70个核苷酸的RNA时，TFIIＥ和TFIIH释放，RNA聚合酶II进入转录延长期。无特定的终止子序列可在无辅助因子参与下终止一串A残基终止转录mRNA:识别末端加尾信号RNA转录后加工和修饰绝大多数原核生物转录和翻译是同时进行的，随着mRNA开始在DNA上合成，核蛋白体即附着在mRNA上并以其为模板进行蛋白质的合成，因此原核细胞的mRNA并无特殊的转录后加工过程，相反，真核生物转录和翻译在时间和空间上是分天的，刚转录出来的mRNA是分子很大的前体，即核内不均一RNA。hnRNA分子中大约只有10%的部分转变成成熟的mRNA，其余部分将在转录后的加工过程中被降解掉。真核生物转录生成的mRNA为单顺反子，即一个mRNA分子只为一种蛋白质分子编码。真核生物mRNA的加工修饰，主要包括对5’端和3’端的修饰以及对中间部分进行剪接。1．在5’端加帽成熟的真核生物mRNA，其结构的5’端都有一个m7G-PPNmN结构，该结构被称为甲基鸟苷的帽子。大多数的真核mRNA都有3’端的多聚尾巴（A)，多聚（A)尾巴大约为200bp。多聚（A)屠巴不是由DNA编码的，而是转录后在核内加上去的。受polyA聚合酶催化，该酶能识别，mRNA的游离3’-OH端，并加上约200个A残基。在大多数真核基因的3’一端有一个AATAA序列，这个序列是mRNA3’-端加polyA尾的信号。靠核酸酶在此信号下游10-15碱基外切断磷酸二酯键，在polyA聚合酶催化下，在3’-OH上逐一引入100-200个A碱基。真核生物基因往往是断裂基因，即编码一个蛋白质分子的核苷酸序列被多个插入片断所隔开，一个真核生物结构基因中内含子的数量，往往与这个基因的大小有关，例如胰岛素是一个很小的蛋白质，它结构基因只有两个内含子，而有些很大的蛋白质，它的结构基因中可以有几十个内含子。经过复杂的过程后，切去内含子，将有编码意义的核苷酸片段（Extron，外显子）连接起来内含子与外显子接界处的高度守恒序列,为准确和有效的剪接过程所必需。內含子5′末端与外显子接界序列为CAAG/GTAGAGT,而3′末端与外显子接界序列为(TC)_πN(CT)AG/G。内含子序列内的各种缺失,并不影响剪接的准确和效率,这似乎说明,内含子的其他部份并不为剪接所要求。mRNA的剪接是基于对间接位点识别的基础上，由被称为剪接体的核酸蛋白复合物完成剪接体包含5种SnRNP和超过200种蛋白质因子。不论拼接过程如何，拼接必须极为精确，否则会导致遗传信息传递障碍，合成的蛋白质可能丧失其正常的功能。我国南方广大地区是β-地中海贫血的高发区，这是由于β-珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制所引起的一种血红蛋白病。实验表明β-珠蛋白基因元1中核苷酸的点突变改变了正常拼接部位的碱基顺序，结果造成错误部位的拼接。加工成熟的mRNA虽能翻译，但产物不是正常的β-珠蛋白，结果引起血红蛋白级结构和功能的改变。原核生物rRNA转录后加工，包括以下几方面：①rRNA前体被大肠杆菌RNaseⅢ,RNaseE等剪切成一定链长的rRNA分子；②rRNA在修饰酶催化下进行碱基修饰；③rRNA与蛋白质结合形成核糖体的大、小亚基真核生物rRNA前体比原核生物大，哺乳动物的初级转录产物为45s，低等真核生物的rRNA前体为38s，真核生物5sRNA前体独立于其他三种rRNA的基因转录。真核生物rRNA前体中含有插入顺序，rRNA前体要形成成熟的rRNA，需要经过拼接反应。例如，四膜虫的rRNA前体的拼接是一种无酶催化的自动拼接过程。四膜虫基因组内，26srRNA编码的区域内有413bp的插入顺序。该插放序列可以不消耗能量从rRNA前体中被除掉。用SDS煮沸和用蛋白酶外理等破坏酶活性办法，都不能破坏拼接活性，但反应中Mg2+和鸟嘌呤核苷酸是必在的。这种有酶催化活性的RNA分子命名为Ribozyme。用32P-GTP进行追踪实验表明，起始过程是GTP在插入顺序5’端发生亲核反应，同时GMP与5’端切点的切除段形成磷酸二酯键并使原RNA断开。第二步是5’切点的外元3’-OH与3’切点的外元5’-P共价连接，获得成熟的rRNA，被切除部分最后环化，形成一个环状结构，同时从5’端去掉一个15核苷酸碎片。剩余部分连接成399核苷酸的环状产物，再经过几步，最后切下一个19个核苷酸的线性内含子序列即L-19，它具有催化活性，上面的剪接作用，是由内含子本身的催化性质决定的。不只是沟通核酸和蛋白质的桥梁，可能是功能比DNA更广泛的信息分子。原核生物和真核生物刚转录生成的tRNA前体一般无生物活性，需要进行①剪切和拼接②碱基修饰③3’-OH连接-ACC结构①tRNA前体在tRNA剪切酶的作用下，切成一定在小的tRNA分子。大肠杆菌RNaseP可特异剪切tRNA前体的5’旁顺序，因此，该酶被称为tRNA5’成熟酶。除了RNaseP外，tRNA前体的剪切尚需要一个3’-核酸内切酶，这可将tRNA前体3’端的一段核苷酸序列切下来。RNaseD是tRNA3’端成熟酶。近年来的研究表明大肠杆菌RNaseP是一种非常特殊的酶分子，它是由RNA和蛋白质组成，最近发现RNAaseP分子中的RNA部分在某些条件下，可以单独地催化tRNA前体的加工成熟，这个发现和四膜虫tRNA能自我拼接被认为是近十年来生化领域内最令人鼓舞的发现之一。说明RNA分子确具有酶的催化活性。经过剪切后的tRNA分子还要在拼接酶作用下，将成熟tRNA分子所需的片段拼起来。在核苷酸转移酶作用下，3’--末端除去个别碱基后，换上tRNA分子统一的CCA-OH末端，完成tRNA分子中的氨基酸臂结构。成熟的tRNA分子中有许多的稀有碱基，因此tRNA在甲基转移酶催化下，某些嘌呤生成甲基嘌呤如A→mA,G→mA。有些尿嘧啶还原为双氢尿嘧啶。尿嘧啶核苷转变不假尿嘧啶核苷。某些腺苷酸脱氨基为成为次黄嘌呤核苷酸（Ⅰ）RNA编辑是指在mRNA水平上改变遗传信息的过程.具体说来，指基因转录产生的mRNA分子中，由于核苷酸的缺失，插入或置换，基因转录物的序列不与基因编码序列互补，使翻译生成的蛋白质的氨基酸组成，不同于基因序列中的编码信息现象。RNA编辑是通过比较成熟的mRNA与相应基因的编码信息时发现的，成熟的mRNA序列中有几种意想不到的变化，包括