分子荧光光谱法(去磷光).

1第二章分子荧光光谱法MolecularFluorescenceSpectrometry2分子荧光光谱是一种发射光谱分析方法。分子荧光光谱法分子吸收能量后，从基态跃迁到激发态。激发态通常是不稳定的，会释放能量而产生跃迁回到基态，如果是以光辐射的形式释放能量，就称为发光。相应的光谱分析法就称为分子发射光谱法。分子荧光是一种光致发光过程。日本富山海边的荧光乌贼用产生不同颜色荧光蛋白的细菌创作的图画荧光棒4分子荧光光谱法2.1分子荧光的产生过程2.2荧光的激发光谱和发射光谱2.3影响荧光强度的因素2.4分子荧光光谱仪2.5分子荧光光谱法的应用5由分子结构理论，主要讨论荧光的产生机理。1.分子能级与跃迁分子能级的每个电子能级上，都存在振动、转动能级；2.1分子荧光的产生过程基态→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；62.电子激发态的多重度2.1分子荧光的产生过程单重态：与基态中的电子自旋方向相反，寿命较短.三重态：与基态中的电子自旋方向相同，寿命较长7基态——S0第一、第二、…电子激发单重态——S1、S2…；第一、第二、…电子激发三重态——T1、T2…；2.1分子荧光的产生过程8电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量的过程；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁2.1分子荧光的产生过程2.分子的去激发过程9S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2内转换振动弛豫2.1分子荧光的产生过程103.分子的去激发形式2.1分子荧光的产生过程振动驰豫同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至相邻低振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12S。见Jablonski能级图113.分子的去激发过程2.1分子荧光的产生过程内转换同多重度电子能级中（如S2→S1，T2→T1）,等能级间的无辐射能级交换。见Jablonski能级图内转换发生的时间约在10-12S。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。123.分子的去激发过程2.1分子荧光的产生过程外转换激发态分子与溶剂和其他溶质分子间的相互作用及能量转移的非辐射跃迁。外转换使发光强度减弱或消失，这种现象称为“猝灭”或“熄灭”。见Jablonski能级图133.分子的去激发过程系间跨跃不同多重态之间如（S1→T1）的一种无辐射跃迁。见Jablonski能级图该过程是激发态电子改变其自旋态，分子的多重性发生变化的结果。即单重态到三重态的跃迁。当两种能态的振动能级重迭时，这种跃迁的几率增大。即较低单重态振动能级与较高的三重态振动能级重叠。这种跃迁是“禁阻”的。2.1分子荧光的产生过程143.分子的去激发过程荧光发射激发态分子由第一激发单重态的最低振动能级S1回到基态S0伴随的光辐射称为荧光。荧光发射是相同多重态间的跃迁，几率较大，速度很快，10-7～10-9s,见Jablonski能级图S04321S143212.1分子荧光的产生过程153.分子的去激发过程磷光发射激发态分子从第一激发三重态（T1）的最低振动能级上返回基态S0伴随的光辐射称为磷光发射。磷光发射是不同多重态之间的跃迁（即T1→S0）。故属于“禁阻”跃迁，因此磷光的辐射速度远远小于荧光，约为10-4到10-5s。所以，将激发光从磷光样品移走后，还常可观察到后发光现象。而荧光发射却观察不到该现象。见Jablonski能级图2.1分子荧光的产生过程16荧光激发光谱，简称激发光谱，测量化合物发射的某一固定波长的荧光的强度（选最大发射波长）与激发光波长的关系曲线；1.荧光激发光谱和发射光谱曲线在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光。激发光谱反映了在某一固定的发射波长下，不同激发波长激发的荧光的相对效率。2.2荧光的激发光谱和发射光谱17激发光谱20025030035040045050055060065070075080085090004008001200160020002400280032003600400044004800IFl固定lem=620nm(MAX)lex=290nm(MAX)固定发射波长(lem)扫描激发波长(lex)荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似2.2荧光的激发光谱和发射光谱18B.荧光发射光谱，又称荧光光谱,固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光与发射光波长关系曲线。2.2荧光的激发光谱和发射光谱发射光谱反映了在相同的激发条件下，不同波长处分子荧光的相对发射强度。1920025030035040045050055060065070075080085090004008001200160020002400280032003600400044004800IFllex=290nm(MAX)固定lem=620nm(MAX)固定lex=290nm(MAX)lem=620nm(MAX)发射光谱(荧光光谱)发射光谱的形状与激发波长无关2.2荧光的激发光谱和发射光谱固定激发波长(lex)扫描发射波长(lem)20212.2荧光的激发光谱和发射光谱在溶液中，荧光光谱显示了某些普遍的特征。为我们识别荧光物质的正常荧光提供了基本原则。3.荧光光谱的特征(1).Stokes位移在溶液中，分子的荧光发射波长总是比其相应的激发波长长。这种波长位移现象是1852年Stokes首次观察到的。222.2荧光的激发光谱和发射光谱荧光总是从最低激发单重态回到基态时所发射的辐射，而激发过程有可能将分子激发到高的振动能级或更高的电子能级上去。振动、热辐射等使分子失去能量。即激发与发射荧光间的能量损失是斯托克斯位移产生的主要原因。其他如溶剂效应、激发态分子的反应也会引起斯托克斯位移。232.2荧光的激发光谱和发射光谱(2).镜像对称规则分子的荧光发射光谱与其激发光谱之间存在着镜像关系。20025030035040045050055060065070075080085090004008001200160020002400280032003600400044004800IFl激发光谱发射光谱242.2荧光的激发光谱和发射光谱镜像对称规则的产生，是由于:大多激发光谱的形状表明了分子的第一激发态的振动能级结构，而荧光发射光谱则表明了分子基态的振动能级结构。S04321S1432125S04321S14321一般情况下，分子的基态和第一激发单线态的振动能级结构类似，因此激发光谱的形状与荧光发射光谱的形状呈镜像对称关系。2.2荧光的激发光谱和发射光谱262.2荧光的激发光谱和发射光谱3.荧光光谱的特征(3).发射光谱不变形或者说荧光发射光谱的形状与激发波长无关。一般地，用不同激发波长激发荧光分子，可以观察到形状相同的荧光发射光谱。这是由于荧光分子无论被激发到哪一个激发态，处于激发态的分子经振动弛豫及内转换等过程后，最终回到第一激发态的最低振动能级。27S04321S14321分子的荧光发射总是从第一激发态的最低振动能级跃迁到基态的各振动能级上（S1→S0）。所以荧光光谱的形状与激发波长无关。2.2荧光的激发光谱和发射光谱28292.3影响荧光强度的因素分子产生荧光必须具备两个条件：①分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光；②吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率。302.3.1荧光量子产率荧光量子产率：也称为荧光效率或量子效率，表示物质发射荧光的能力。可以定义为物质吸光后发射的荧光的光子数与吸收的激发光的光子数之比值。）吸收的光强（）荧光强度（吸收的光子数发射的光子数affII31返回基态速率强荧光物质：荧光发射无辐射跃迁大低荧光物质：无辐射跃迁发射荧光小因此，荧光量子效率与荧光发射过程的速率及无辐射过程的速率有关。2.3.1荧光量子产率32式中，kf是荧光发射过程的速度常数，ki是系间跨跃和外转换等有关无辐射跃迁过程的速率常数。iffkkk一般而言，kf主要取决于分子的化学结构，而ki主要取决于化学环境。分子结构发光分子所处的环境因此，影响物质荧光强度的因素主要有两个：2.3.1荧光量子产率332.3.2影响荧光强度的因素一般地，具有强荧光的分子都具有大的共轭π键结构，同时，给电子取代基，刚性的平面结构均有利于荧光的发射。因此，分子中至少具有一个芳环或具有多个共轭双键的有机化合物才容易发射荧光，而饱和的或只有孤立双键的化合物，不呈现显著的荧光。结构对分子荧光的影响主要表现在以下几个方面：1.分子结构342.3.2影响荧光强度的因素(1)共轭效应产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，离域大π键的电子越容易激发，荧光越容易产生。化合物苯萘蒽丁省戊省λexmax(nm)205286365390580λemmax(nm)278321400480640F0.110.290.460.600.52芳香族化合物容易发生荧光，能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少。352.3.2影响荧光强度的因素(2)结构刚性效应可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。实验表明，具有刚性结构的分子容易产生荧光。若荧光染料吸附在固体表面上，由于固体表面提供的附加刚性，也会使荧光增强。362.3.2影响荧光强度的因素芴联苯f=1.0f=0.237偶氮苯杂氮菲382.3.2影响荧光强度的因素此外，分子的这种平面刚性结构效应对许多金属配合物的荧光发射也有影响。如:8-羟基喹啉本身的荧光强度远比其锌配合物低。利用这种性质可进行痕量金属离子的测定。392.3.2影响荧光强度的因素(3)取代基效应给电子基团，如-NH2、-OH、-OCH3、-NHCH3和-N（CH3）2等，使荧光增强；原因：产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。402.3.2影响荧光强度的因素(3)取代基效应吸电子基团，如-Cl、-Br、-I、-NHCOCH3、-NO2和-COOH等，使荧光减弱。原因：n→π*跃迁的摩尔吸光系数、量子产率均低于π→π*跃迁。π→π*跃迁是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。41小结：强荧光的有机化合物具备下特征:①大的共轭π键结构；②刚性的平面结构；③取代基团为给电子取代基。2.3.2影响荧光强度的因素422.3.2影响荧光强度的因素(1)溶剂效应溶剂对荧光光谱的影响主要是由于溶液的介电常数和折射率等因素的作用，这称为一般溶剂效应，这种效应是普遍存在的。除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；一般地，增大溶剂的极性，光谱红移。这是由于π→π＊跃迁的能量减小，从而使荧光光谱向长波方向移动。2.环境因素432.3.2影响荧光强度的因素(2)温度的影响一般地，随温度降低，溶液中荧光物质的量子效率和荧光强度将增大，并伴随光谱的蓝移。原因：温度降低，介质的粘度增大，溶剂的驰豫作用大大减小。温度升高，碰撞频率增加，外转换的去激发几率增加。因此，选择低温条件下进行荧光检测将有利于提高分析的灵敏度。442.3.2影响荧光强度的因素(3)pH的影响对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言，溶液的pH将对这类物质的荧光强度产生较大的影响。因此在荧光测量中往往需要控制溶液的pH值。NH3OHHNH2NHOHHpH5无荧光5~12蓝色荧光12无荧光苯胺阳离子苯胺分子苯胺阴离子452.3.2影响荧光强度的因素(4)散射光的影响瑞利(Reyleigh)散射光—光子和物质分子碰撞时，未发生能量交换，仅运动方向发生改变，波长与入射光波长相近，由溶剂、容器、胶体等散射引起—选择适当的波长，由单色器消除溶剂的拉曼（Raman）光散射—光子和物质分子碰撞时，运动方向发生改变，同时发生能量交换，波长与荧光波长相近，随激发光改变而改变，由空白溶剂产生。—采