分子遗传学

第一章1.基因组（Genome）：由德国汉堡大学威克勒教授于1920年首创，指生物的整套染色体所含有的全部DNA或RNA序列。基因组是地球上每一物种具有的生物学信息的存储库。2.基因组学（Genomics）：由罗德里克于1986年首创，指研究生物的整个基因组，涉及基因组作图、测序和功能分析的一门学科。3.ranscriptomes:基因组表达的最初产物是转录组，即那些含有细胞在特定时间所需生物信息、编码蛋白质的基因衍生而来的RNA分子的集合。转录组由转录过程来维持。4.proteomes:基因组表达的第二个产物是蛋白质组，即细胞中那些决定细胞能够进行生化反应的所有蛋白质组分。这是通过翻译过程来完成的。5.证明基因由核酸(DNA或RNA)组成的3个著名实验：①肺炎双球菌的转化试验；②噬菌体感染实验；③烟草花叶病毒的感染实验。6.DNA双螺旋结构模型：由WatsonandCrick(1953)提出的DNA分子通常以右手双螺旋形式存在，两条核苷酸链反向平行，且互为互补链。戊糖－磷酸骨架在分子的外铡，在分子表面形成大沟和小沟，碱基堆积于螺旋内部.碱基间通过氢键相互连接，A和T以2个氢键配对，G和C以3个氢键配对.螺旋中相邻碱基间相隔0.34nm，每10个碱基对螺旋上升一圈，螺距为3.4nm，直径为2.37nm。7.DNA双螺旋结构的稳定力：①碱基间形成的氢键，②相邻碱基间的疏水堆积力，③碱基相互作用的范德华力。8.基因表达系列分析（Serialanalysisofgeneexpresion,SAGE）：SAGE技术不是研究完整的cDNA，它产生长度12bp的短序列，每一条都代表了转录组中存在的一种mRNA。技术基础：412=16,777,216bp，真核mRNA平均1500bp，412相当于11,000个转录物，这比最复杂的转录组中存在转录物数目还多，因此12bp序列能够代表某一种mRNA。9.通过微阵列或芯片分析来研究转录组109拷贝，过量优点：可用于快速评估两个或多个转录组间的差异。10.Thefourlevelsofproteinstructure⑴primarystructure：氨基酸通过肽键连接成一条多肽链。⑵secondarystructure：指多肽采取的不同构象，由不同氨基酸之间形成的氢键所稳定。例如：螺旋；片层⑶tertiarystructure：是将多肽链的二级结构组分折叠成为三维构型而形成的。它被各种化学力所稳定：①氨基酸残基间的氢键；②带电荷的氨基酸R基团间的静电相互作用；③疏水相互作用；④半胱氨酸残基间的二硫键⑷quaternarystructure：两条或更多已形成三级结构的多肽链组合在一起形成一个多亚基蛋白质。11.鉴定与某一蛋白质相互作用的蛋白质：a.噬菌体展示：该技术采用了一种基于噬菌体或某种丝状噬菌体的独特的克隆载体。b.酵母双杂交：激活因子（转录因子）：一类控制基因表达的蛋白质，包含DNA结合结构域和转录激活结构域。双杂交系统使用缺乏某一报告基因相应激活因子的酿酒酵母菌株，此时报告基因是不表达的。12.编码RNA和功能RNA的区别：编码RNA占总RNA的4%,codingRNA----hnRNA------合mRNA功能RNA:占总RNA的96%,合成pre-rRNA,pre—tRNA,sn-RNA(核小RNA),sno-RNA(核仁小RNA),mi-RNA(微小RNA),si-RNA(短干扰RNA).第二章1.DNA重组技术：借助工具酶按预定的方式操作DNA分子，将DNA分子切成小片段，并重新将它们连接在一起，形成自然界不存在的组合体。2.不同类型的酶：①末端修饰酶：改变DNA分子末端，为连接实验的设计增加可操作空间。A.末端脱氧核糖核苷酸转移酶：属于模板非依赖的DNA聚合酶。B.碱性磷酸酶：去掉DNA分子5’端磷酸基团，从而阻止这些分子连接到其他分子上。C.T4多聚核苷酸激酶：向DNA分子5’端添加磷酸基团，主要用于DNA分子的末端标记。②DNA聚合酶：以现有DNA或RNA分子为模板合成DNA的酶，称为（依赖模板的）DNA聚合酶。③核酸酶④DNA连接酶：通过DNA连接酶可以将限制性内切核酸酶消化产生的DNA片段重新连接起来，或者连接到一个新的分子上。T4DNA连接酶：从T4噬菌体感染后的大肠杆菌细胞中提取。3.研究中使用的DNA聚合酶类型①DNA聚合酶I(Kornberg聚合酶)的不同版本，②Klenow聚合酶：用枯草杆菌蛋白酶处理DNA聚合酶I，可获得两个片段，大片段的分子质量约76kDa，保留聚合酶活性和3’5’外切核酸酶活性，又叫Klenow片段。小片段的分子质量约34kDa，具有5’3’外切核酸酶活性。DNA重组研究中所使用的不同类型酶的活性及主要作用；明确DNA聚合酶的重要特征，区分基因组研究中所使用的各种DNA聚合酶；说明限制性内切酶切割DNA的方式；区分平端与粘端连接，并说明如何提高平端连接的效率；详述克隆载体的主要特征，并描述如何将这些载体用于克隆实验中；列举用于克隆长片段DNA的载体，并评价每种载体的优缺点；描述如何进行PCR反应。第三章1.遗传图谱：指应用遗传学技术（遗传重组）构建的能在基因组上显示基因和其它序列特征位置的线性排列图，反映了基因或标记间的相对距离和顺序。cM物理图谱：指应用分子生物学技术直接分析DNA分子，从而构建的能显示包括基因在内的序列特征位置的图谱，它反映了基因或标记间的实际距离。bp，kb，Mb2.用于遗传学作图的遗传标记遗传标记：可以示踪染色体、染色体某一片段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特征。可分为：a.形态标记b.细胞学标记c.生化标记d.DNA分子标记所有的标记都必须具有多态性！分子标记:指在DNA水平，具有相对差异的等位基因的DNA多态性标记，是DNA水平上遗传变异的直接反映。优点：a.不受时间和环境的限制b.遍布整个基因组，数量无限c.不影响性状表达d.变异丰富，多态性好e.大部分为共显性，能鉴别纯合体和杂合体A.限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）用限制性内切酶酶切基因组DNA时，在同一种生物的不同个体间出现含同源序列的酶切片段长度的差异。B.简单重复序列(Simplesequencerepeat,SSR,Microsatellite(微卫星)指重复单位相对较小（2-6bp的基序），由于重复单位数目的变化而形成的多态性。C.单核苷酸多态性（Simplenucleotidepolymorphism,SNP）基因组中的某些位点上，有些个体只有一个核苷酸与其它个体不同，这种分散在基因组中的单个碱基的差异就称为SNP。a.通过寡核苷酸杂交分析检测SNP(1)DNA芯片技术：应用面积为2cm2或更小的玻璃或硅质晶片，在上面高密度的排列着许多寡核苷酸，待测DNA用荧光标记后与芯片杂交，再用荧光显微镜检测，发出荧光的表明寡核苷酸与待测DNA杂交上了。此方法在一次实验中可以检测许多个SNP。(2)液相杂交技术：在微量滴定板的孔中进行，每个孔中含有一种不同的寡核苷酸；寡核苷酸的一端与荧光染料连接，另一端与荧光淬灭复合物连接，且其两个末端可以形成碱基配对；当淬灭复合物与荧光染料相邻时，无荧光发出；如果寡核苷酸与待测DNA能够杂交，则会破坏环形结构，此时淬灭复合物远离荧光染料，有荧光发出。b.通过耐扩增突变系统检测SNP（AmplificationRefractoryMutationSystem,ARMS）将SNP位点引入PCR引物3’端的最后一个碱基，直接进行PCR扩增。在严谨的PCR条件下，存在SNP的引物对不能扩增出目的条带。3.遗传图谱的局限性：a.遗传图谱的分辨率依赖于所得到的交换数目；b.遗传图谱的准确率有限4.物理作图的常用方法：1)限制性作图：在DNA分子上定位限制性内切酶酶切位点的相对位置；2)荧光原位杂交（FISH）：将分子标记与完整染色体杂交来确定标记的位置；3)序列标签位点（STS）作图：通过对批量的基因组片段进行PCR和（或）杂交分析，来对短序列进行定位作图。A.限制性作图（Restrictionmapping）a.双酶解（doubledigest）Key：分析重叠片段b.部分酶解+完全酶解：比较分析这两种情况下的片段大小。c.末端标记+部分酶解①利用放射性的同位素标记DNA的3’端或5’端②部分酶解③放射自显影B.荧光原位杂交（FISH）原位杂交是以标记的DNA分子为探针，检测完整染色体的一种杂交分析方法。C.序列标签位点作图（STS作图）用STS技术绘制物理图是到目前为止最为有效的方法。STS其实只是基因组中任何单拷贝的短DNA序列，长度在100-500bp，但要求序列已知且在染色体上有唯一的定位。要得到至少5套包含相关染色体或整个基因组的DNA片段（染色体上每一点平均有5个片段相对应），然后用各个DNA片段做模板，用不同STS标签上的序列做引物进行PCR扩增，筛选阳性克隆。A.任何一个唯一的DNA序列均可作为STS一个DNA序列要成为STS，要满足两个条件：①它的序列必须是已知的，以便于用RCR方法检测该STS在不同DNA片段中存在与否；②STS必须在拟研究的染色体或基因组上有唯一的定位。因此，需要确保STS不位于重复DNA区域。可以通过以下途径获得STS：⑴表达序列标签（EST）：通过对cDNA克隆测序获得的短序列，代表了表达的基因的一部分。如果EST来自单一序列DNA，不是基因家族中的某一成员，可以被用作STS；⑵简单序列长度多态性（SSLP）：如果将被遗传定位的SSLP用作STS进行物理定位，会很有价值，因为它们可以在遗传图谱和物理图谱间提供直接联系；⑶随机基因组序列：通过对克隆的基因组DNA随机小片段测序获得。B.用于STS作图的DNA片段群①STS作图必需的第二个要素是覆盖拟研究的染色体或基因组5倍以上的DNA片段群（作图试剂）。②作图试剂可以来自克隆文库和放射杂交体组。6.放射杂交体：利用高剂量的射线将供体细胞染色体打断成若干小片段，再与近缘物种的受体细胞融合，形成放射杂交体；该方法由GossandHarris（1975,1977）最先提出，后又经Benhametal.（1989）逐步完善，早期主要被用于人类及其它哺乳动物高通量染色体图谱的构建。目前，放射杂交作图已从最初仅适用于单条染色体作图发展到全基因组作图。放射杂交作图是基于染色体上的两个STS相距越近其通过断裂分开的频率越低的原理，通过PCR方法研究细胞中供体的STS的分布，利用统计学的手段计算STS间的断裂分离频率，从而可以推算出STS间的距离和在染色体上的排列顺序。使用PCR方法鉴定STS时，必需保证其只能从供体，而不能从受体基因组中扩增出相应片段。目前，在大麦、小麦、玉米、棉花中都有构建放射杂交图谱的报道。第四章1.链终止DNA测序法基本原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开。链终止法测序的起始材料是均一的单链DNA分子。a.首先由短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，并充当引物合成与模板互补的新DNA链。b.在测序反应体系中加入少量的被不同荧光标记物标记的双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）后，合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生一系列只差一个核苷酸的DNA分子。c.通过PAGE电泳可以读出待测DNA分子的序列。链终止法测序需要单链DNA模板,制备单链DNA的方法：(1)把DNA克隆到质粒载体中，再通过碱或煮沸变性形成单链DNA。缺点是质粒DNA会被少量的细菌DNA或RNA污染。(2)把DNA克隆到M13噬菌体载体中。在噬菌体颗粒中，DNA分子以单链形式存在。缺点是该系统只能用于短片段DNA，大于3kb的片段被克隆到M13载体后会发生缺失和重排。(3)把DNA克隆到噬菌粒中。噬菌粒是一种质粒克隆载体，除含有自身的复制起点外，还包含来源于M13噬菌体的起始位点。如果大肠杆菌中既有噬菌粒又有噬菌体，噬菌粒上