分子遗传学5

第六章转录后加工转录后的加工（posttranscriptionalmodification）多数转录的初始产物并无活性，必须经过进一步的加工处理才有生物学活性，特别是对于真核生物，其转录产物的后加工更为重要。转录后加工包括：（1）减少部分片段：如切除5′端前导序列，3′端拖尾序列和中部的内含子；（2）增加部分片段：5′加帽，3′加poly(A),通过编辑加入一些碱基；（3）修饰：对某些碱基进行甲基化等。第一节tRNA和rRNA的加工一、原核的tRNA和rRNA的加工参与蛋白质合成的tRNA和rRNA都不是最初的转录产物，它们都需要后续加工：(1)它们的5′端都是单磷酸，而原始的转录产物5′端应是三磷酸；(2)分子比初始转录物小；(3)tRNA含有特殊的碱基，这些碱基只有通过一些化学修饰才可以得到。表13-1E.coli中含有的小分子核酸酶酶基因底物功能RNasePrnpAtRNA5′端内切RnaseOrnpBRnaseBN?tRNA3′端外切RnaseDrndtRNA3′端外切RnaseT?tRNA3′CCA外切RnaseⅢrncrRNA和mRNA内切RnaseR?rRNA和mRNA外切RnaseErne5SrRNA内切RnaseⅠrna大部分RNA内切RnaseⅡrnbRNA外切多核苷酸磷酸化酶pnpRNA外切RnaseHrnhRNA-DNA杂合链内切《GENES》IV，1990.B.Lewin,Table14.2(一)tRNA的加工tRNA的加工分成3个阶段(1)“斩头”，形成5′末端；(2)去尾，形成3′-OH末端。缺-CCA的tRNA要用tRNA核酸转移酶加-CCA。(3)修饰：通过甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等进行修饰，如氨基酸臂的4-硫尿苷（4tu），D臂的2甲基鸟苷（2mG），TψC臂的假尿苷（ψ）和反密码子环上的2异戊腺苷（2ipA)tRNAIletRNAAlatRNAAsptRNATrp16S23S5SRNaseIIIRNaseIIIRNaseIIIRNaseIIIRNaseRRNaseRRNaseRRNaseRRNaseR图13-rRNA的加工二、真核的tRNA和rRNA的加工真核tRNA的基因和原核不同：(1)tRNA的前体分子中含有内含子;(2)真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多得多，如酵母约有400个tRNA基因；(3)5′端单磷酸核苷酸，表明已被加工过；(4)真核的前体分子tRNA是成簇排列，基因间有间隔区。真核tRNA的加工和原核的区别(1)真核tRNA前体中无二聚体和多聚体；(2)增加了剪接内含子的过程；(3)都要加CCA。真核tRNA内含子的特点：①位置相同，都在反密码子环的下游；②不同tRNA的内含子长度和序列各异；③外显子和内含子交界处无保守序列；④内含子的剪切是依靠RNase异体催化；⑤内含子和反密码子配对形成茎环。成熟的tRNA前体tRNACGGAAUGCmAYmCAUYGAA反密码子酵母tRNAPhe内含子的结构子CGGAAUGCmAYCGAUCUGGCAUAUGCAAAAAAUUAGAGAUC真核细胞中rRNA的加工途径(1)切除5′端的前导序列；(2)从41S的中间产物中先切下18S的片段。Hela细胞的切点在18S和5.8S之间的ITS（内部转录间隔序列）；L细胞的切点在18S序列和ITS的交界处，称为先成熟。(3)部分退火，形成发夹结构；(4)最后修正。1剪切位点5’3’18S5.8S28S人类HeLa细胞途径：小鼠L细胞途径：45S41S41S32S36S20S18S18S32S28S－5.8S28S－5.8S第二节前体mRNA的加工mRNA前体分子的加工主要是真核mRNA，原核的mRNA一般不经过加工。真核mRNA的加工一般要经过四步：(1)5′加帽；(2)3′加尾；(3)切除内含子；(4)修饰：对某些碱基进行甲基化。真核mRNA前体的加工(一)核内不均一RNA（heterogenousnuclearRNA,hnRNA）平均分子长度为8-10Kb(2Kb~14Kb)左右。比mRNA的平均长度（1.8-2Kb）要大4-5倍。hnRNA仅有总量的1/2转移到细胞质内，其余的都在核内被降解掉。hnRNA是mRNA的前体，证据是：(1)hnRNA和mRNA有相同的序列；(2)hnRNA在体外能作为模板翻译蛋白；(3)两者5′端都有帽子结构；(4)表明二者为相同的聚合酶所合成；(5)两者的3′端都有多聚腺苷有尾巴。hnRNA的结构的特点(1)5′端有帽结构；(2)3′端有poly（A）尾巴；(3)帽结构后有3个寡聚U区，每个长约30nt；(4)有重复序列，位于寡聚U区后面；(5)有茎环结构，可能分布于编码区（非重复序列）的两侧；(6)非重复序列中有内含子区。5’m7pppNmNUUUUAAAAA……3’寡聚U区ds单一序列dsPoly(A)RNARNA图13-hnRNA的结构模型1．加帽(1)剪接前加帽如呼肠病毒，牛豆病毒(2)剪切后加帽如疱疹病毒和口炎病毒帽子结构的功能(1)有助于mRNA越过核膜，进入胞质；(2)保护5′不被酶降解；(3)翻译时供IFⅢ（起始因子）和核糖体识别。(2)加尾(1)特殊组分(CPSF)识别AAUAAA并指导其它的活性(2)剪切因子(CF)在加尾位点AAUAAA下游11－30nt处剪切RNA；(3)末端腺苷转移酶[poly(A)聚合酶]合成poly(A)尾巴；(4)PBP与poly(A)结合，反应停止。转录起始延伸5’帽子AAUAAA剪切Poly(A)聚合酶5’帽子AAUAAAAn图13-mRNA3’端加Poly(A)尾巴加Poly(A)的反应第一步加一个短的寡聚A序列（10nt），此反应依赖于AAUAAA序列；反应由poly（A）聚合酶在特殊因子指导下完成的。第二步是寡聚A尾巴延伸到240nt的长度。此反应并不需要AAUAAA序列，但需要一个识别寡聚A并指导poly（A）聚合酶延伸的刺激因子。加上～200A后反应停止复合体解离5’3’CPSFCFⅡAAUAAACstFCFⅠPAP5’3’CPSFCFⅡAAUAAA3’CstF5’CFⅠPAPCPSFAAUAAAAAAAAA3’CstFPAPPBPCPSFAAUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3’CstFAAUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3’图13-3’端加尾反应和相关的蛋白质因子CPSF：specificitycomponentCstF：剪切活化因子CF：cleavagefactorsPBP：Poly(A)结合蛋白(GENESVIFig.30.28)各种3’加工成分组装成复合体剪切因子(CF)产生3’端3’末端Poly(A)聚合酶(PAP)加APBP与Poly(A)结合第三节内含子的剪接一.核酶(Ribozyme)1981年T.Cech和S.Atman等在研究四膜虫rRNA时发现的；T.Cech由核糖核酸（ribonucleicacid）和酶（enzyme）这两个词“重组”成一个新的词：“Ribozyme”；是指本质为RNA或以RNA为主含有蛋白质辅基的一类具有催化功能的物质。和传统酶的区别：(1)一般的酶是纯的蛋白质，而核酶是RNA或带有蛋白的RNA；(2)核酶既是催化剂又是底物。而酶仅催化反应。核酶发现的意义（1）突破了酶的概念.是一种自体催化；（2）揭示了内含子自我剪接的奥秘；促进了RNA的研究。（3）为生命的起源和分子进化提供了新的依据。酶组成的进化路线可能是：纯RNA→RNA为主→RNA和→蛋白为主→纯蛋白蛋白为辅蛋白并重RNA为辅核酶RNAaseP？端粒酶一般酶类二．I类类含子的剪接Cech等1981年用四膜虫分离得到了35S的前体rRNA，它含有一个长413bp的内含子。此35SrRNA要加入一价或二价阳离子及GTP就可以在体外释放出413b的线性的内含子，若继续保温，那么线形内含子又可形成环状的RNA。这就意味着35SRNA在GTP的作用下可以自我剪接。(一)I类内含子的结构特点是1.其边界序列为5′U-G3′；2.具有中部核心结构（Centralcorestrucature）3.内部引导顺序（internalguideseguenceIGS）(二)I类内含子的剪切机制转酯反应(transesterification)酯键从一个位置转移到另一个位置。三.Ⅱ类内含子的剪接(一)结构特点(1)边界序列为5′↓GUGCG……YnAG↓；(2)有6个茎环结构；有分支点顺序（branch-pointseguence）(二)剪接机制无需鸟苷的辅助，但需镁离子的存在。分枝点A的2′-OH对5′端交界处的磷酸二酯键发动亲核进攻，产生了套索（lariat）结构（图13-31）；切下的外显子1其3′-OH继续对内含子3′端的交界序列进行亲核进攻，同时释放出套索状的内含子。