分生复习总结

1名词解释：1、退火（annealing）:两条寡核苷酸引物在适当温度下，分别依据碱基互补结合在模板DNA扩增区域两端，称为退火。2、表达载体：指用于在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体。除了具备复制起始位点、筛选标志和多克隆位点3个基本元件外，还需带有外源基因在真核或者原核细胞中表达（转录和翻译）所必须的DNA构件，如：启动子、终止子、阻遏蛋白结合位点、核糖体结合位点等。3、多克隆位点：（MCS，multiplecloningsites）载体上含有的一个人工合成的DNA片段，其上含有多个单一酶切位点，是外源DNA的插入部位。具备条件：是载体中的一段碱基序列，由数个酶切位点组成。这些位点在载体上都是单一位点。4、非融合性蛋白：指利用DNA重组技术，将一段外源基因导入细菌后，自身单独表达的、不与细菌中表达的任何蛋白质或多肽相融的外源蛋白产物。5、目的基因：指要研究或应用的基因，也就是要克隆或表达的基因或者基因的一个片段。6、Genomics:基因组学，是阐明整个基因组结构、结构与功能关系以及基因之间相互作用的科学。根据研究目的不同而分为3个不同的亚领域：1.结构基因组学（structuralgenomics）整个基因组的遗传制图、物理制图及DNA测序。2.功能基因组学(functionalgenomics)认识、分析整个基因组所包含的基因、非基因序列及其功能。3.比较基因组学(comparativegenomics)比较不同物种的整个基因组，增强对各个基因组功能及发育相关性的认识。7、SNP：singlenucleotidepolymorphism，单核苷酸多态性，是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。在人群中SNP的发生频率至少大于1%，SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种，也是基因组中最为稳定的变异。其最大程度地代表了不同个体之间的遗传差异，因而可作为研究多基因疾病、药物遗传学及人类进化的重要遗传标记。8、假基因：（pseudogenes，ψ）是指与某些有功能的基因结构相似，但不能表达产物的基因。假基因的产生是由于功能基因发生突变或cDNA插入所致。由突变而引起的功能缺失通常是在编码区引入了终止密码子，这种假基因称为重复假基因或传统假基因。由插入了mRNA反转录生成的cDNA而造成的假基因称为加工假基因或返座假基因。9、杂合子丢失（lossofheterozygosity，LOH）:是指从亲代遗传而来的受精卵开始就带有某等位基因突变的杂合子个体再次发生遗传损伤，导致野生型显性基因突变或缺失形成突变纯合子，失去原有的杂合状态。举例：视网膜母细胞瘤发生的“二次打击理论”认为：亲代遗传而来的一个rb基因或生殖细胞已经遭受一次打击（RB变为rb），此RB/rb杂合子再次发生损伤可使得原有的正常RB也丢失，由此引起癌变。10、Oncogene：癌基因，指细胞内控制细胞生长和分化的基因，它的结构异常或表达异常，可以引起细胞癌变。广泛存在于从单核细胞到人类在内的基因组中，在进化上高度保守，表达产物对细胞的正常生长、增殖与分化发挥着精密的调控作用，异常活化往往促进细胞恶性转化，诱导肿瘤发生。包括所有编码生长因子、生长因子受体以及与生长相关的信号分子2和转录因子的基因。11、基因诊断（genediagnosis）：是利用现代分子生物学技术从DNA/RNA的水平进行检测，分析体内致病基因的存在、变异和表达状态，从而对疾病作出诊断的过程。12、基因治疗(：是通过将外源性正常基因导入病变细胞中、或将特定的基因导入非病变细胞、或向功能或生物学特性异常的细胞中导入细胞本不表达的基因等，使导入基因表达产物在体内发挥作用，或采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因，从而达到治疗疾病目的的一种方法。13、生物信息学：是一门新的前沿交叉学科，采用数理和信息科学理论、技术和方法研究生命现象，理解和组织与生物分子相关的信息。目前的研究重点和关键突破主要是在基因组学和蛋白质组学两方面，是人们能够从核酸和蛋白质的序列数据开始，经一系列分析手段归纳和预测其中所蕴藏的关于结构与功能的信息。14、表观遗传学：是指在DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。其特征可概括为DNA序列不变，可遗传，具有可逆性。在分子角度也可定义为“在同一基因组上建立并将不同基因表达（转录）模式和基因沉默传递下去的染色质模板变化的总和”。15、染色质重塑：染色质和单个核小体内发生的任何可检测到的变化。重塑的染色体表现为对核酸酶高度的敏感以及组蛋白结构和位置改变等特点。目前已知有两类复合体调节染色质重塑：ATP依赖的染色质重塑复合体和染色质共价修饰复合体。16、CpGisland：CpG岛，CpG指“CG”核苷酸对，其中G在DNA链中紧随C后。在脊椎动物中，CpG二核苷酸是最重要的甲基化位点，它在人类基因组中呈不均匀分布。但在一些区域CpG常成簇存在，人们将这段富含CpG的DNA称为CpG岛，通常长度在1-2kb左右。CpG岛常位于转录调控区附近，在基因组中，约有60%以上基因的启动子含有CpG岛，它的甲基化与基因的转录调控密切相关。17、RNAi：RNAinterference,RNA干扰，是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（dsRNA）诱发的、有特定酶参与的同源mRNA高效特异性降解（特异性基因沉默）的现象。它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。18、反式作用因子（trans-actingfactor）：又称转录因子（TF），指存在于真核细胞内、能识别并结合特定的DNA序列，使基因开放或关闭的一组序列特异性的DNA结合蛋白。TF一般具有三个功能结构域:DNA识别结合域，转录激活域，蛋白质-蛋白质结合域；能特异性识别和结合顺式作用元件；结合后通过促进或抑制转录起始复合物形成过程中的各步反应，以激活或阻遏下游基因的表达。问答题：1.试述PCR技术的基本原理、过程和引物设计原理。（1）基本工作原理：在体外模拟体3内的DNA复制的过程，以拟扩增的DNA分子为模板；用2个寡核苷酸片段作为引物，分别在拟扩增片段的DNA两侧与模板DNA链互补结合，提供3‘—OH末端；在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，不断重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。PCR反应的特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。(2)过程：在反应管中加入反应缓冲液、dNTP、DNA模板和DNA聚合酶，混匀后加石蜡油封盖液面防止反应液的挥发。然后将反应管置于PCR仪中开始以下循环反应。1、变性：加热使双链DNA模板解旋成单链（T：95℃左右）。模版DNA在95℃左右的高温条件下双螺旋的氢键断裂，双链DNA解链成为单链DNA并游离于反应液中；（解链）2、退火：降温使引物与DNA模板互补区域结合形成杂交链（T：55℃左右）。两个寡核苷酸引物在适当温度下，分别依据碱基互补结合在模版DNA扩增区域两端，DNA聚合酶开始合成新链；（引物与模版连杂交，新链开始合成）3、延伸：温度升至72℃左右，TaqDNA聚合酶催化以引物为起始点的5'→3'DNA链延伸反应，形成新生DNA链。在4种dNTP底物及Mg2+存在下，DNA聚合酶在最适作用温度下将单核苷酸按碱基互补配对原则从引物的3`-端掺入，使引物沿着5`→3`方向延伸合成新股DNA。每一循环的产物再继续作为下一循环的模版。（合成新链）每一循环的产物再继续作为下一循环的模板。循环次数：25～35，不超过40次(3)引物设计总原则：提高扩增的效率和特异性。一般原则：1、长度：16～40个核苷酸，以18-24个为最佳。2、引物末端：3′端的碱基最好选T、G、C而不选A。3、引物内、引物间不应有互补序列4、引物应位于基因组DNA的保护区，且与非特异扩增区无同源性5、引物的GC含量和Tm值:G+C碱基含量应保持在40%-75%之间，以维持Tm在56-62℃范围内。6、3′端必须与模板DNA互补配对，3′端的碱基最好选T、G、C而不选A。7、5′端可游离，添加修饰位点。（3）引物设计原理：引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。①引物的位置：用于基因组DNA的引物序列应位于基因组DNA的保守区，且与非扩增区无同源序列。若以cDNA为模版，则首先应尽力使引物和产物保持在mRNA的编码区内，其次尽量将引物放到不同的外显子上，以便使特异的PCR产物与从污染DNA中产生的产物在大小上相区别；②引物的长度：每一条引物长度（与模版DNA序列互补的部分）以18~24mer为最佳；③引物末端：3`-端碱基最好选T、G、C而不选A，5`-端碱基无严格限制。一对引物之间4不应存在互补序列，每一个引物内部也应避免形成二级结构；④引物的GC含量和Tm值：G+C碱基含量应保持在40%~75%之间，以维持Tm在56~62℃范围内。2.制备目的基因常用的方法有哪几种？简述重组DNA的基本过程。制备目的基因常用的方法有：酶切法直接获得目的DNA片段；体外扩增合成目的DNA片段；筛选文库获得目的DNA片段；化学合成－PCR搭接法获得目的DNA片段。也可用计算机克隆法：首选对拟克隆的DNA序列在种属间进行同源性或相似性比较，找出目的DNA的保守序列并作为引物合成靶序列以减少盲目性。重组DNA基本过程包括：①欲进行重组的DNA片段（目的基因）的获取；②载体的选择及准备；③目的DNA片段与载体的连接；④重组DNA导入宿主细胞；⑤含重组DNA宿主细胞的克隆化及鉴定。五大环节。一、(1)构建基因组DNA文库后从中筛选目的基因（2)构建cDNA文库后从中筛选目的基因(3）设计一对目的基因引物，用PCR或RT-PCR技术体外扩增目的基因片段(4）化学合成已知序列的长度不是太大的DNA片段（5)直接用限制酶从基因组DNA、或cDNA片段，或含目的基因的重组体上切取。重组DNA技术的基本过程：①制备目的基因和相关载体。②将目的基因和有关载体进行连接③将重组的DNA导入受体细胞④DNA重组体的筛选和鉴定⑤DNA重组体的扩增、表达和其它研究（或）1、载体的选择和制备——分；2、制备目的基因片段——切3、DNA片段的重组连接——接；4、重组DNA导入受体细胞——导5、转化子的筛选——筛；6、重组子的筛选——筛；7、重组子的鉴定——鉴8、克隆扩增或表达——扩/表；9、基因工程的后处理——分3、简述表达载体和克隆载体在结构上的异同。（1）克隆用质粒载体的结构简单，其主要功能是可携带目的DNA在宿主细胞中复制扩增，从而经过克隆筛选获得克隆筛选获得重组DNA。pBR322和pUC18/19是经典代表，目前用的多是改进而来的。结构上含有复制起始点，筛选标记，多个单一酶切位点（获多克隆位点MCS）。（2）表达用质粒载体是在克隆载体的基础上，加上用于插入基因能够在宿主细胞（原核细胞或真核细胞）内表达所需的必要元件，如启动子、终止子、核糖识别位点等。①原核表达的质粒载体：除具备一般克隆载体所具有的必要元件外，还需要在MCS的上下游分别提供启动子和终止子，从而使其与插入基因共同组成完整的转录单位。②真核表达质粒载体：一般由两部分组成，一部分用于在原核细胞中复制及筛选，一部分用于在真核细胞中复制、筛选及表达。5（一）克隆载体的结构：（a）必须是一个复制子，能在受体细胞中复制：1、复制起点Ori。2、复制区。3、复制终点term。（b）带有抗药性基因：Tetr：编码膜蛋白，阻止Tet进入细胞；Ampr：β-内酰胺环水解酶；Kanr：Kan～P,neo～p；Camr：氯霉素乙酰基转移酶（C）具有多克隆位点（d）可导入受体细胞（二）表达载体的结构：表达载体=克隆载体+表达元件原核表达载体：“启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号”；真核表达载体的基本转录元件：原核序列（克隆用）+真核序列（表达用）复制子真核抗药基因+真核表达元件抗药基因（或真核复制起始点）真核表达元件：“启动子/增强子—克隆位点—转录终止信号—poly(A)加尾信