华中农业大学病毒学实验技术第六章病毒纯化(XXXX)

第六章病毒的纯化利用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。病毒微细结构的研究病毒抗原蛋白的分离纯化病毒化学成分及其遗传物质的研究病毒感染的分子细节的研究一、病毒纯化的标准保持感染性具有均一性：结晶形成检测病毒制备物均一性的方法：电镜观察：大小、形态均一超速离心：沉降速率和密度一致，只出现一条沉降带电泳：颗粒大小及表面电荷均一，只形成一条电泳带免疫学方法：只与特异性抗体发生反应大小、形态、密度、化学组成、分子量、抗原性二、病毒纯化的理论依据病毒体外表面的主要化学组成是蛋白质，可利用蛋白质提纯的方法纯化病毒病毒体具有一定大小、形状和密度，可利用超速离心技术提纯病毒三、病毒纯化前的预处理1、病毒感染的组织、脏器或细胞研磨匀浆超声波处理反复冻融低速离心去掉细胞碎片2、细胞培养液、鸡胚尿囊液低速离心去掉可能含有的杂质或直接用于病毒的分离纯化沉淀法超速离心法超滤法层析法两相溶剂间分配系数法吸附法电泳法四、病毒纯化的方法（一）沉淀法主要从稀的病毒悬浮液中浓缩病毒。中性盐沉淀法（盐析）聚乙二醇沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法皂土法鱼精蛋白沉淀法1、中性盐沉淀法（盐析）先用其它方法去除材料中的大量杂质，再以高浓度的中性盐溶液盐析，析出的沉淀用缓冲液悬浮后再进行盐析，反复几次后，悬浮沉淀，用透析法或其它方法脱盐。病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持感染性。2、聚乙二醇（PEG）沉淀法用于病毒沉淀的分子量：2000-6000将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。3、有机溶剂沉淀法乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物原理：A、降低溶液的介电常数，从而增加病毒颗粒表面不同电荷之间的引力，导致其溶解度降低。B、与水作用，破坏蛋白质分子的水化膜。优点：分辨力高，易除去缺点：易使表面蛋白质变性，溶解脂质4、等电点沉淀法（分辨力不高）原理：病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉淀（分辨力不高）。多数病毒的等电点在pH4.０~5.5之间。5、皂土法轮状病毒皂土在酸性条件下（pH4~4.5)可吸附轮状病毒，在碱性条件下(pH8.5)，又使其洗脱下来。6、鱼精蛋白沉淀法（沉淀直径大于50nm的病毒）鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质（直径大于50nm）共沉淀的作用，当向这种沉淀物加入1mol/LNaCl时，其它蛋白质又重新释放到悬液中，而鱼精蛋白仍然沉淀。（二）层析法葡聚糖柱层析法凝胶层析法离子交换柱层析法亲和层析法（三）两相溶剂间分配系数法原理：溶质在两个互不相溶的溶剂中分配系数的不同而选择性地分配于其中的一方。常用的溶剂：葡聚糖硫酸盐（dextransulphate,Ds)聚乙二醇（PEG）甲基纤维素（MC）聚乙烯醇（PVA）分配体系：Ds-PEG系、Ds-PVA系、Ds-MC系（四）吸附法原理：利用对病毒或对杂质有选择吸附能力的固体吸附剂吸附病毒或吸附杂质，再用一定的盐溶液把它们洗脱下来。作为吸附剂必须具备的特点：有较大的表面积和吸附能力较高的吸附选择性便于洗脱性质稳定常用吸附剂：白土磷酸钙硅藻土红细胞离子交换树脂羧甲基纤维素（六）超滤法利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将一定大小的大分子或病毒等颗粒截住从而使后者得到浓缩。优点：可用于大容量样品的浓缩可以在室温或低温下操作对被浓缩产物的损害小浓缩的同时可达到部分纯化回收率高可防止外来污染（五）电泳法（七）离心法差速离心速度区带离心法密度梯度离心1.差速离心法原理：不同大小和比重的粒子沉降速度不同。用途：从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞吸附释放的病毒悬液中提纯病毒。优点：可快速处理大量样品步骤：低速（2000-3000r/min,20-30min)、中速（10000min,20-30min)去除较大的宿主细胞碎片、污染的细菌及其它较大的杂质。再选择较高速度离心1-2h使病毒沉淀。速度梯度离心法密度梯度离心法原理沉降与颗粒质量成正比，以物质沉降速度的不同进行分离沉降与颗粒密度成正比，以物质浮密度的不同进行分离介质密度小，1-1.3286，预制梯度，不连续密度大，1-1.9025，连续梯度离心力场强，离心速度高，使被分离物质易沉降稍强，速度相对低，使CsCl形成梯度，建立沉降扩散平衡离心过程样品向离心管底沉降样品停留于介质的等密度部位离心时间较短，几小时到几十小时较长，十几小时到数天2.速度梯度离心法与密度梯度离心法A.速度梯度离心B.密度梯度离心…………AB五、病毒纯化应注意的问题1、保持病毒的感染性严格控制温度、pH及试剂的选择。2、选用适宜的纯化实验起始材料无其它病毒或毒株的污染病毒体的含量高杂质含量少并易于处理3、根据具体情况选择提纯方法根据需要纯化的病毒的性质、起始材料的特点、研究的目的以及实验室的条件等，选择适宜的纯化方法。4、建立灵敏的病毒鉴定和测定方法六、伪狂犬病毒的浓缩提纯1、病毒材料将伪狂犬病病毒接种于PK-15细胞，病变后收集细胞培养物，反复冻融3次，即为样品材料。2．病毒提纯浓缩去细胞碎片及杂质：将细胞培养物4℃3000r/min离心30min，收集上清液。硫酸铵沉淀：按100ml病毒液42.5g硫酸铵的量加入硫酸铵，搅匀后置4℃冰箱搅拌沉淀过夜，4℃5000r/min离心40min，去上清，沉淀用适量的灭菌ddH2O悬浮。透析：将悬浮的病毒液装于透析袋中，于ddH2O或PBS中搅拌透析，每半个小时换一次液，共换5次，第5次透析过夜。浓缩：透析完成后，取出，用聚乙二醇或蔗糖将病毒浓缩至合适的体积。超离纯化：在离心管中加入不同浓度的甘油垫层，即先加入45%甘油，再加入5%甘油。加入病毒悬液（应不超过离心管总容积的10%）。20000-25000r/min离心2h。弃上层液体，沉淀用适量TEN重悬（涡旋或超声波处理，使沉淀分散）。速度区带离心密度梯度离心在离心管中加入不同浓度的CsCl或蔗糖垫层，再加入病毒悬液，超高速离心。蔗糖密度梯度离心：在离心管中加入20%～60%不连续蔗糖密度梯度,20000-25000r/min离心2h～3h，收集蔗糖浓度为35%处的病毒带，加入适量缓冲液稀释后，再次20000-25000r/min离心2h，沉淀用适量TEN重悬。PrV鄂A株电镜观察左图：上带中的PrV粒子右图：下带中的PrV粒子浓缩（方法二）将经低速离心去掉细胞碎片及杂质的病毒悬液直接20000-25000r/min离心2h。弃上层液体，沉淀用适量TEN重悬。将重悬的病毒液再经梯度离心纯化。如何利用纯化的病毒进行下一步的研究研究病毒的结构研究病毒感染的分子细节病毒粒子的标记研究与受体的结合研究病毒的侵入研究病毒在体内的移行病毒纯化质谱分析靶蛋白验证纯化的病毒是不是只含有病毒的蛋白？PRV如何侵入细胞免疫金标记确定病毒的细胞受体解析病毒侵入细胞的分子细节是当前病毒感染研究的重点InternalizationofIHNVparticlesthroughclathrin-mediatedendocytosis利用量子点(quantumdots)标记研究病毒的侵入