华中农业大学精品课程 细胞工程文本教案

华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学2004-7主讲教师：柳俊博士、教授细胞工程文本教案教学目的与要求：细胞工程是现代生物技术的重要组成部分，同时也是现代生物学研究的重要技术工具。要求学生通过本课程的学习掌握生物组织、器官及其细胞离体培养的原理与技术，为从事生物学领域的相关研究及其与细胞工程有关的生物技术产业奠定良好的理论和技术基础。理论知识方面，重点掌握本学科的基本原理和基本技术即：细胞全能性学说在细胞工程中的指导作用；培养条件下的细胞分化和器官发生的调控；离体培养条件下的遗传与变异特点。掌握不同组织、器官的培养特点和控制方法。了解细胞工程的各类技术在现代生物学与生物技术领域的应用途径与发展潜力。实践技能方面，重点掌握细胞工程的基本操作技术—无菌操作；掌握外植体选择、愈伤组织和胚状体诱导、器官发生调控等基本技术；了解细胞大批量培养方法，原生质体分离与体细胞杂交技术。课程学时及其分配：课程总学时60，其中课堂教授40学时，实验20学时。课堂讲授内容及学时分配表章节内容学时绪论2第一章实验室设置及技术原理2第二章细胞全能性与形态发生6第三章离体培养下的遗传与变异4第四章植物组织和器官培养5第五章植物细胞培养及次生代谢产物生产5第六章原生质体培养4第七章植物体细胞杂交4第八章人工种子2第九章植物种质资源离体超低温保存2第十章动物细胞工程概述41华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学2004-7主讲教师：柳俊博士、教授绪论（2学时）教学目的与要求全面了解细胞工程与现代生物技术的关系；了解细胞工程的发展与相关学科的联系；了解细胞工程在现代世界经济中的潜力。第一节细胞工程在生物技术领域中的地位一、生物技术概述生物技术是以生物科学为基础，利用生物个体或生物器官、组织、细胞的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系（包括细胞系），以及与工程原理相结合进行产品加工生产的综合性技术体系。生物技术的内涵主要是：运用现代生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质，培育出人们需要的生物新品种；工业规模地利用现有生物体系，制备生物产品；模拟生物体系，以生物化学工程代替化学工程，制备工业产品；发展相应的科学理论与工程技术。主要技术范畴包括：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程以及生化工程。现代生物技术特征：多学科性；商业性；规模化。二、细胞工程的概念及研究范畴细胞工程（cellengineering）是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术，狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。根据研究对象不同，细胞工程可分为动物细胞工程和植物细胞工程。2华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学2004-7主讲教师：柳俊博士、教授动物细胞工程包括：细胞培养技术（包括组织培养、器官培养）；细胞融合技术；胚胎工程技术（核移植、胚胎分割等）；克隆技术（单细胞系克隆、器官克隆、个体克隆）。植物细胞工程包括：植物组织、器官培养技术；细胞培养技术；原生质体融合与培养技术；亚细胞水平的操作技术等。三、细胞工程与其它相关学科的关系1．细胞工程学科的建立依赖于相关学科理论的发展2．为生物学研究提供新的实验体系3．细胞工程必须与其它生物技术相结合才能更好地发挥作用四、细胞工程在现代生物技术中的地位及其实践意义1．改善农业生产技术2．保护自然资源，维护生态平衡3．生物医药开发第二节动物物细胞工程的发展一．融合现象的发现19世纪30年代，Muller,Schwann,Virchow等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病理组织中观察到多核细胞现象，但当时并没有引起人们的关注，认为这只是一种特殊现象。1849年Lobing在骨髓中也发现了多核现象的存在，1855年～1858年，科学家们在肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核细胞。至此，自然界中广泛存在着多核细胞的事实，才被生命科学工作者接受。1859年，A.Barli在研究黏虫的生活史时发现，某些黏虫存在着由单个细胞核融合形成多核的原生质团的情况。据此，他认为多核细胞是由单个细胞彼此融合而形成的。二.动物组织细胞培养技术的建立1907年，美国胚胎学家R.Harrison将蛙的胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液凝块中，这片组织在体外不但存活了若干星期，而且还从细胞中长出了轴突(神经纤维)细胞，解决了当时关于轴突起源的争论，并表明了利用体外存活的组织进行实验研究的可能性。他所采用的把培养物放在盖玻片上并置于凹玻片腔中培养的方法还一直沿用至3华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学2004-7主讲教师：柳俊博士、教授今。Carrel(1911)发现了鸡胚浸出液对于某些细胞的生长具有很强的促进效应，还把无菌技术引到了组织培养技术中。作为他的技术标志是，他在不含抗菌素的培养条件下使鸡胚心脏细胞维持生存了34年，先后继代3400次，证明动物细胞有可能在体外无限地生长。1914年，Thomson创立了另一条完全不同的体外组织培养途径－器官培养法，以后又被Strangeways和Fell所发展。1940年，Earle建立了可以无限传代的一个C3H小鼠的结缔组织细胞系－L系。二是1951年，Gay建立了第一个人体细胞系－人体宫颈癌Hela细胞系三.细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生1958年,Okada发现紫外灭活的仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。由于仙台病毒能稳定地诱发细胞融合而引起了许多科学家的兴趣，60年代，Harris(1965)诱导不同的动物体细胞融合获得成功并能存活下来。Lifflefield(1964)根据亲本细胞的酶缺陷型，利用HAT选择性培养基能使亲本细胞死亡而只留下异型融合细胞，并能不断地增殖，从此形成了细胞融合到杂种细胞选择、培养的一整套技术。使这一技术在此后广泛地应用于遗传学、病毒学、免疫学、细胞学等多种学科的研究工作中。1975年，免疫学家Kohler和Milstein利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种细胞。该杂种细胞具有在小鼠体内和体外培养条件下大量繁殖的能力，并能长期地分泌单克隆抗体，从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术。这一技术的诞生把细胞融合技术从实验阶段推向了应用研究阶段，促进了动物细胞工程的蓬勃发展。四.动物克隆技术的建立1891，Heape等人首次报道了家兔胚胎移植成功的结果，他们把安哥拉家兔胚胎移植给比利时兔，得到了4只安哥拉家兔。本世纪30年代以后，先后在羊、猪、牛等动物的胚胎移植上获得成功。经过几十年的不断完善和充实，已成为一项比较成熟的繁殖生物学技术。首例克隆动物成功的报道是在1962年，英国学者Grudon把非洲爪蟾小肠上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵(经紫外线照射杀死卵细胞核)中，约有1％的重组卵发育成为成熟蛙。这一成功开创了由体细胞培育动物个体的新型实验途径，其贡献在于：实验证明了4华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学2004-7主讲教师：柳俊博士、教授完全分化的肠细胞仍然具有未分化细胞的全部遗传信息，并能在一定的条件下发育成动物个体，从而证明了动物细胞仍然具有全能性；初步建立了体细胞核移植的实验体系，证明在体细胞核转至胚胎发育方向的早期，卵细胞质对体细胞核的发育功能起着关键性的调节作用，其作用因子可能是细胞质中的mRNA与有关的蛋白质。1997年2月，英国科学家Wilmut等在世界权威杂志《Nature》上首例报道了世界第一只克隆羊的诞生。它的贡献在于：实验证明了哺乳动物高度分化的细胞同样含有全套遗传信息，亦能在一定条件下发育成动物个体，进一步证明了动物细胞的全能性。**多利诞生的技术路线：取6岁供体羊乳腺细胞—血清饥饿培养使细胞处于G0期经GnRH处理取卵细胞—移去卵细胞的细胞核将培养的乳腺细胞的核移植到去核的卵细胞中重组细胞植入第一受体羊输卵管中培养至胚泡期(桑椹胚)桑椹胚再移植入第二受体羊子宫内发育至分娩第三节植物细胞工程的发展植物细胞工程是一门以植物组织和细胞的离体操作为基础的实验性学科。它是以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程统称为植物细胞工程。植物细胞工程是在植物组织培养的基础上发展起来的，因此，植物细胞工程亦是广义概念上的植物组织培养。一．探索阶段在这一阶段中，细胞学说的产生和细胞全能性学说的提出为组织培养技术的产生奠定了理论基础。在这些理论的指导下所开展的有关试验，对组织培养技术的建立进行了有益的探索。细胞学说（celltheory）是Schleiden和Schwann分别于1838年和1839年提出的，其核心内容是，细胞是有机体，亦是生物体的基本结构单位，由它构成整个生物个体。同时，植物细胞又是在生理和发育上具有潜在全能性的功能单位。随后，Schwann在1839年更明确的指出：“如果具有与有机体内一样的条件时，每个细胞应该可以独立生活和发展”。这一论点已成为组织培养研究的思想基础。细胞全能性学说是德国著名植物学家G.Haberlandt在细胞学说的基础上于1902年提出的。他认为，高等植物的组织、器官可以不断分割，直到单个细胞。如果每个细胞都有植物个体一样的性质和能力，那么，可以通过植物细胞培养使单个细胞发育成为一个新个体。5华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学2004-7主讲教师：柳俊博士、教授二．培养技术建立阶段作为一门技术，它必须具有一定的程序性。也就是说，它应该具有一定的技术模式。在这一阶段，植物组织培养建立了两个与培养技术有关的重要模式，一是培养基模式，二是激素调控模式。三．应用研究阶段其一，组织培养领域的研究迅速在世界各国的有关实验室广泛展开。其二，技术体系更加完善。这一阶段的技术体系包括：根据不同的培养目的外植体的取材和灭菌方法，不同外植体及其培养产物的培养程序，适合于不同植物种类和外植体类型的培养基等。其三，形成了较为完整的理论体系。在植物组织培养研究的基础上，植物细胞工程现已形成了以细胞全能性为基本理论基础，以细胞脱分化和再分化调控为中心的理论体系。其四，研究目的性更加明确，并已广泛应用到生物科学研究的各个领域，以细胞工程为基础的新型生物技术产业正在兴起。四．植物细胞工程应用在植物育种上的应用将常规植物育种技术与植物组织培养技术相结合，可以获得常规技术难以或无法获得的种质材料，缩短育种周期，提高育种效率。快速获得特殊倍性材料；克服远缘杂交不亲和；克服杂种胚早期夭折；导入外源基因；突变体筛选；种质资源保存种苗脱病毒与快速繁殖细胞培养生产有用次生产物在细胞生物学和发育生物学研究中的应用在植物遗传、生理生化以及植物病理等基础研究中的应用思考题1．细胞工程的概念、研究范畴、在生命科学中与其它学科的关系。2．动物细胞工程发展的主要标志性阶段。3．植物细胞工程技术的发展阶段与标志性成就。4．植物细胞工程的作用与应用领域。6华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学2004-7主讲教师：柳俊博士、教授第一章实验室设置及一般技术（2学时）教学目的与要求：了解细胞工程的通用技术，初步掌握细胞工程实验技术中的培养基配制、灭菌以及无菌操作的原理与操作方法。第一节实验室设置细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；无菌操作；控制培养。一．实验室组成1．基本实验室准备室准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。接种室接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外，应行密闭。培养室培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培