16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程

16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23SrRNA。16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列。16SrDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。在16SrRNA分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16SrDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。3对引物正反向测通后，拼接成1500bp左右的16SrDNA序列。3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL、100μL、10μL）；涡旋振荡器；EppendorfMixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti96WellThermal1115R519R1492R926F357F27F16SrDNACycler；凝胶成像仪：VersaDocMP4000；基因分析仪：AB3500、AB31303.2试剂DNA快速提取试剂：PrepManUltra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×TaqBuffer(Mg2+)，dNTPs，ddH2O等；ExoSAP-IT；测序试剂：BigDyeTerminator，5×SequencingBuffer；BigDyeXTerminatorPurificationKit；3.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；MicroAmpTMOptical96-WellReactionPlate；MicroAmpTMOpticalAdhesiveFilm；3.4引物16SrDNA名称序列扩增长度第1部分正向引物27F5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'500bp左右反向引物519R5'-GWATTACCGCGGCKGCTG-3'第2部分正向引物357F5'-CTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'750bp左右反向引物1115R5'-AGGGTTGCGCTCGTTGC-3'第3部分正向引物926F5'-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3'560bp左右反向引物1492R5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'其中M=C:A,Y=C:T.K=G:T,R=A:G,S=G:C.W=A:T;all1:14.操作流程5.实验方法5.1核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepManUltra的离心管中，涡旋震荡混匀30s左右，然后100℃水浴10min后，以离心机最大转速离心3min，取10μL上清液与490μLddH2O（即稀释50倍），混匀作为下步PCR的模板DNA。提取的DNA于-20℃保存。5.2基因扩增5.2.1PCR反应体系试剂使用量（25μL体系）模板DNA2μL（10ng~100ng）Taq酶(5U/μL)0.2μL10×TaqBuffer(Mg2+)2.5μLdNTPs(各2.5mM)2μL引物F(1μM)5μL引物R(1μM)5μLddH2O8.3μL核酸提取基因扩增序列比对产物纯化测序反应备注：DNA模板量通常在100ng以下，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板使用量。PCR反应体系应在冰中配置，然后置于冰箱中冷却3~5min，最后放于PCR仪上进行反应，这种冷启动法可增强PCR扩增的特异性。5.2.2PCR反应条件94℃：10min94℃：30s58℃：30s72℃：45s72℃：5min4℃：∞5.2.3电泳称取1g琼脂糖置于100mLTAE电泳缓冲液中，加热融化，待温度降至60℃左右时，均匀铺板，制成1%的琼脂糖凝胶。PCR反应结束后，加样，以100V电压进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，染色，用凝胶成像仪观察，拍照，记录实验结果。5.3产物纯化5.3.1每5μLPCR产物加入2μLExoSAP-IT试剂，混匀。5.3.2放入PCR仪中，37℃温育15min,80℃温育15min。5.3.3纯化后的PCR产物做为下一步测序反应的模板。5.4测序反应5.4.1测序反应体系试剂使用量（10μL体系）模板DNA1μL引物(1μM)1.6μLBigDyeTerminator1μL5×SequencingBuffer1μLddH2O5.4μL5.4.2测序反应条件96℃：2min96℃：30s55℃：15s60℃：4min4℃：∞5.4.3测序反应纯化(BigDyeXTerminatorPurificationKit)5.4.3.1每管加入27μLSAMSolution和6μLBigDyeXTerminatorSolution。30Cyc30Cyc5.4.3.2放在EppendorfMixMate上2000rpm震荡30min。5.4.3.3在离心机上以1000×g离心2min。5.4.3.4每管吸取10μL上清液于96孔板中，放入测序仪中测序。5.5序列比对基因测序仪得到的测序结果，在MicroSEQ微生物鉴定系统中进行比对，得到菌种的种属信息。6.关键说明6.1提取细菌基因组DNA时，对于细胞壁比较薄的革兰氏阴性细菌，可挑取一菌环菌株，置于100μLddH2O中，混匀，沸水热变性10min后，离心3min分离，稀释50倍后做为PCR模板。必要时做梯度PCR确认最佳的模板量。6.2PCR及测序反应时，为了保证酶的活性，整个体系应在冰中配置；然后置于低温冰箱中冷却3~5min，最后放于PCR仪上进行反应，这种冷启动法可增强PCR扩增的特异性。6.316SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。具体参照附录。PCR出现非特异性条带的原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。模板浓度过高10ul体系100ngDNA附录（资料性附录）1.细菌16SrDNA三部分的PCR结果电泳图M：DL2000；1：引物27F和519R的PCR产物（第1部分500bp）2：引物357F和1115R的PCR产物（第2部分750bp）3：引物926F和1492R的PCR产物（第3部分560bp）M750bp1000bp100bp2000bp123500bp250bp2.细菌16SrDNA鉴定结果2.116SrDNA前500bp即可反映细菌的种属信息：菌株TL140924的鉴定结果2.216SrDNA前500bp不足以反映细菌的种属信息：菌株70528的鉴定结果2.316SrDNA的全序列信息：菌株70528的鉴定结果如附录2.2、2.3所示，当待测菌株的16SrDNA前500bp序列不足以将待测菌株与库中菌株区分时，则需要测其16SrDNA全长序列以将其区分。