分子生物学实验的常见问题与解决方案-1

广州搬家公司金鲨银鲨一、Southern杂交问题1：电泳后发现凝胶中DNA扩散，导致结果难以确定，如何解决这一问题？解决方案：（1）在操作上：电泳时隔孔上样，电泳后要对凝胶及时处理使凝胶干燥；（2）琼脂糖的质量应该较好，尤其是不应含有内切酶，否则有时将使低拷贝数基因的杂交结果难以解释。问题2：传统方法中转膜不完全的问题如何克服？解决方案：经典的向上转移法会使凝胶短时间内变薄,此时即使延长转移时间至24小时以上,也不能使大分子DNA良好地转移出去,因此,转膜不完全。向下转膜法由于不需在吸水纸上增加重量,凝胶基本不变形；加之吸水纸的吸力与水受到的重力方向一致,故可以良好地完成DNA的转移,它不需要特殊的仪器,转移速度较快,转移效率高。利用地高辛标记探针进行Southern杂交时，对于大于15kb的DNA片断，转膜之前用盐酸进行脱嘌呤可以促进转膜效率,但脱嘌呤过度可导致分子量相对较小的DNA被打断成过小的片段而难以和尼龙膜结合。如果实验转膜过程中同时含有大于15kb的DNA(通常为基因组)和小片段DNA(通常是基因组酶切产物)，那么在转移的过程中倾斜容器，仅使凝胶上半部分浸泡于盐酸，这样既可以提高大片断DNA的转移效率，又不会打碎小片段DNA。另外，等采用琼指糖凝胶直接杂交的方法，来解决这一难题：以转基因鼠的检测为例，实验步骤如下：1.转基因鼠的建立：以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5’调控区指导人G-CSF基因为构件，建立转基因小鼠。转基因小鼠的检测采用剪取鼠尾DNA做Southern进行鉴定。2.琼脂糖凝胶直接杂交:(l)用BanHI(150U)对由假孕鼠产生的仔鼠剪尾提取基因组DNA10μg酶切过液，取少量电泳检查酶切完全后，上样电泳8小时，(2)将电泳槽板连同凝胶置50℃放置3小时，用镊子轻轻揭起凝胶，放于变性液(0.5MNaOH，0.5MNaCl)20分钟，转置中和液(0.5MTrisHCl，0.15MNaCl)20分钟，将胶放于玻璃板上沥干液体，室温放置30分钟。(3)干胶应立即杂交。先将胶在水中泡一下，以利于操作。(4)将胶放人杂交液(6×SSC、广州搬家公司金鲨银鲨×Denhardt’S、0.25%SDS、100μg/ml鲑鱼精DNA)，加人探针，42℃杂交16-20小时。(5)杂交完成后，洗膜8轮，42℃每次15分钟。2×SSC、0.1%SDS、1×SSC、0.1SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、各洗两次，在冰水中浸泡2分钟，以利于盐的排出。(6)干燥后按检测试剂盒操作，室温压片0.5-2小时。冲片照相。使用的探针为G-CSF。DNA，探针标记采用Fluorescein-12-dUTP，检测试剂盒为杜邦公司产品，操作按试剂盒说明书进行。用琼脂糖凝胶直接杂交的方法，较好地解决了微量核酸或低拷贝数转基因的检测问题，结果不仅直观，而且特异性好。与常规的Southern杂交相比，它所具有的优势是，它省略了将DNA进行转膜的步骤，从而避免了因转膜不完全所造成的DNA量的损失，特别是低拷贝数基因的丢失。另一方面，也使复杂的Southern杂交操作程序大大简化。因此，在转基因鼠的鉴定中以及微量核酸检测、疾病诊断中是防止低拷贝数基因漏检的一种可行途径。问题3：在向下转膜法中，如何提高转膜效率？解决方案：1、转移液的水平面应略低于凝胶的水平面。如果转移液的水平面高于凝胶，短时间内会有大量液体聚集在凝胶上，直接从侧面流失；果转移液的水平面过分低于凝胶，影响纱布的吸水力，转移效率下降。2、吸水纸吸水后易变形，使吸水纸与滤纸间产生空隙，而降低吸水纸的吸水效率，应及时更换吸水纸。3、过夜转移时，及时添加转移液，防吸干。4、样本丰度高时，移时间可以缩短至1小时，此时凝胶上仍可见大分子量DNA的残留，当样本丰度低时，以延长转移时间。5、纱布上不要加盖重物，防凝胶受压变薄，响转移效率。问题4碱转移结束后的尼龙膜潮湿不利于保存，且防止长期保存过程中DNA结合不紧密影响杂交效果，应如何做？解决方案：将尼龙膜置于滤纸上干燥片刻，在紫外交联仪中将转有DNA的一面向上12000J交联4min，若尼龙膜暂不杂交，可在4℃下保存备用但存放时间不宜超过半年。问题5使用碱转移法，将导致杂交后探针的去除困难，几乎80%-90%的探针难以洗脱，如何解决这一问题？广州搬家公司金鲨银鲨解决方案：将煮沸的5g/LSDS溶液倒在膜上,待溶液自然冷却至室温,可除去膜上已杂交的DNA探针。洗脱后的尼龙膜,可反复用于其他探针的杂交(至少可耐5轮杂交与洗脱)。问题6：Southern杂交中，探针的背景高，应如何解决？解决方案：用随机引物法标记的探针要想得到最低的背景，在向尼龙膜上加prob-DIGEasyHyb混合物前,要用0.45μm醋酸纤维素膜过滤，勿用硝酸纤维素滤膜过滤。对每一个探针和目的片段，总是要根据经验确定最合适的杂交条件，探针浓度很关键，如果太高，将会非特异性结合到膜上；太低，敏感性会降低。利用地高辛标记探针进行Southern杂交时，以下2种措施可降低背景：(1)适当延长梯度洗膜的时间和提高洗膜温度；(2)控制地高辛抗体的浓度。使用足够量的地高辛抗体可以获得较好的杂交信号,但过量的地高辛抗体会在膜上产生非特异结合斑点。问题7：Southern杂交没有检测出出杂交信号的原因，如何解决？解决方案：（1）目的DNA在总DNA中所占的比例，一般需要10μgDNA样品,如果样品中目的基因含量较高,可以按比例减少DNA用量。如果基因组中目的基因的拷贝数较低,致使常规的基因组用量不能满足Southern杂交的需要,此时可加大基因组的用量；（2）探针的浓度和比活性：在杂交袋中杂交需要0.2ml/cm2的杂交液；使用圆筒状瓶子进行杂交可以使用较小的体积，约0.1ml/cm2。（3）转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对：（见问题2，3）二、蓝白斑筛选问题1：做蓝白斑筛选只见白斑，不见蓝斑，该如何做？解决方案：（1）做空白对照，将没有进行重组的宿主菌直接接入含有IPTG和X-galLB琼脂糖平板在37℃下培养17小时以上以便显色。显色后将平板置于4℃两小时，蓝色会加深。如果正常显色，说明试剂，培养基及菌没有问题，如果不广州搬家公司金鲨银鲨能正常显色，更换试剂重新配置培养基或者接入新的菌种，再次培养，确保空白对照结果正确。（2）若空白试验结果正确，用牙签挑取白色菌落，进行PCR扩增，同时设立阳性、阴性和空白对照。阳性对照为经测序确认含有相同大小插入片段的重组菌落，阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落，空白对照为不加模板的PCR体系。PCR扩增产物通过非变性PAGE条带分析，确定是否重组，即PCR扩增后的反应液中加入2μl的6×上样缓冲液，混匀，上样至已预电泳的10％非变性PAGE加样孔中，200V电压电泳后，取胶至EB液中染色30min，最后在紫外灯下数码照相。比对结果，判断白斑是否为重组子。问题2：做蓝白斑筛选时，只见蓝斑，不见白斑该如何做？解决方案：（1）做空白对照，将没有进行重组的宿主菌直接接入含有IPTG和X-galLB琼脂糖平板在37℃下培养17小时以上以便显色。显色后将平板置于4℃两小时，蓝色会加深。观察对照的蓝色是否和实验组的颜色一样，如果实验组的蓝色较浅，可能载体带有插入片段，但没有阻断lacZ阅读框。（2）用牙签挑取浅蓝色菌落，进行PCR扩增，同时设立阳性、阴性和空白对照。阳性对照为经测序确认含有相同大小插入片段的重组菌落，阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落，空白对照为不加模板的PCR体系。PCR扩增产物通过非变性PAGE条带分析，确定是否重组，即PCR扩增后的反应液中加入2μl的6×上样缓冲液，混匀，上样至已预电泳的10％非变性PAGE加样孔中，200V电压电泳后，取胶至EB液中染色30min，最后在紫外灯下数码照相。比对结果，判断浅蓝色菌落是否为重组子。三、外源基因在大肠杆菌的表达问题1：外源基因在大肠杆菌中高效表达易形成包含体，包含体形成有利于表达产物的纯化，但降低产生大量不具有生物活性的产物，如何降低包涵体的形成？解决方案：（1）采用胰胨-磷酸盐培养基能够限制包含体的形成。（2）培养液中加入甜菜碱和山梨醇来改变渗透压，使表达产物由包含体形式转变为活性状态，将温度从37℃降低到25℃时诱导表达，可降低包含体的形成。（3）选用pMBI衍生而来的载体质粒，因为其可以协同表达DnaK-DnaJ或GroEL-GroES，增加凝结蛋白的溶解度。分子伴侣折叠作用效率与细胞DnaK-DnaJ和GroEL-GroES的浓度有关，与表达蛋白的性质有关。广州搬家公司