关于HPLC的一些常见问题

关于HPLC的一些常见问题1.HPLC应用范围及其作用；2.溶剂瓶；3.进样器；4.液相色谱柱；5.预柱（保护柱）；6.检测器；7.常用术语；8.仪器的日常维护。1.HPLC应用范围及其作用HPLC高压（0-40Mpa），高速（几分钟-小时），高灵敏度（10-8mg/ml）的特点，并且能适用于高沸点（350℃），大分子（1000），热稳定性差的各种组分分析，因此分析范围很广，可以对80%的有机物进行分离、分析工作。除化工外，它可用于农药，医药，生物化工等其它众多行业，近年来特别是在药物化学，生命科学中的DNA等的检测分离也得以广泛应用。另外，HPLC的分析对样品不需要作预先处理，操作简便。总之，简单地来讲，使用HPLC来分析的主要目的在于分离一个混合物中各个组分，并定量出各组分在混合物中所占的比重。比如分析药物（如感冒药），就是要了解该药物中含有那些成分，起治疗效果的是其中的那些组分，这些组分的比重含量又是多少？通过HPLC的分析，就能取得这些数据资料，这对于药物的进一步改进与制备是相当重要的。也正是基于这些分析手段与数据，人们才能准确地从药物中提取有效的活性组分，以提高药效（如人参中提取人参皂苷）。2.溶剂瓶溶剂瓶是指用来贮放洗脱溶剂（流动相）的容器，大小一般有0.5、1.0、1.5、2.0L。容器通常是玻璃或内表涂有聚四氟乙烯的不锈钢材料的。这些材料惰性好，化学性能稳定，适宜保证流动相组分的恒久、均一。国外有些特殊的溶剂瓶设有静电导出装置，更有利于操作安全与流动相的稳定。贮放于溶剂瓶中的溶剂必须是脱气的，即将溶解在溶剂内的微量空气从溶剂中排出。脱气的主要目的在于避免溶剂进入高压泵后，溶解的微量空气在柱后被减压放出形成气泡，从而严重影响到样品组分的检测与基线稳定，甚至分析系统无法正常工作（除溶须剂脱气外，系统其它地方也绝不允许有任何空气存在，否则将影响流量、柱压与样品分离以及检测）。溶剂脱气常用有三种方法（如下图），在国内常用超声脱气，效果较后两者差，但经济实用，亦能取得较好的脱气效果。国外常用吹氦脱气与在线脱气，效果好，但费用昂贵。3.进样器进样器是一种将分析样品引进色谱柱（二相交互区）进行分离分析的装置。进样的种类主要有手动进样与自动进样两种。自动进样即将所有手动过程都机械化控制了，操作人员只须将大量的待测样品处理后装进分析样品瓶，按编号放入自动进样器的工作架中，然后启动液相色谱仪器或或工作站上的控制程序即可完成所有的分析工作。当然也能实现远程控制。自动进样器的优点显而易见，工作效率高，节省人力物力，分析结果准确、重现性好。但整套装置价格昂贵，国内用户一般很少使用，在此不作过多介绍，详细参见相关书籍资料。自动进样器的基本工作步骤如下：控制器依据样品序号或指令，将某样品定位于进样针下方（或将进样针移位于某样品瓶的上方），插针、抽取样品、进样阀切换、进样（进样阀的另一通道始终与柱进样器相连接）。接下来可能是用清洗瓶中的溶剂冲洗针管后恢复到原始待进样状态，至此自动进样器完成了一个完整的工作过程。手动进样分为两类：针进样与阀进样。在这里，针进样指用针管吸进样品后插入柱前的进样头，将样品推进，完成进样。这种方式基本已淘汰，没有实用价值（主要是进样重复性差（进样量、进样时间），并且只能低柱压下进样，密封性也差），但其直接的柱头进样，减小了柱前样品扩散，形成塞状（点状）进样，使得其拥有各类进样器中最高的分离柱效。它需要熟练的操作人员才能完成。手动进样的另一种方式就是阀进样，液谱系统中经常采用的进样阀是美国产的7725i阀件。这是一种平面六通阀，其取样、进样依靠阀通道位置的切换来完成，自动进样器中广泛使用的也是这类阀件。进样阀分为二块。一块是固定的平面，平面上分布着间隔六个固定孔位。其中1、4#孔位连接一根定量管（定量管是根有固定容积的空管子，用来定量移取样品，一般有10ul、20ul），2、3#孔位分别接有溶剂进出的管路，5#孔位为样品放空孔位或连接抽液泵，6#孔位是清洗或进样放空用的。另一块则是能够相对转动一定角度（60°）的平面体，上面只有一个孔位，即在其1#位上有一个孔位与背面的进样针孔位始终连接（进样针穿透到此为止，不会送抵到固定块平面上），其余取而代之的是相应的二条（23#、45#）固定的沟槽。进样时将阀顺时针转动60°即可，此时12#、34#相连，溶剂流将定量管中的样品推送进色谱柱内。阀进样、自动进样由于能耐高压、可准确定量进样，使得样品进样的重复性可以做到非常优秀、完美。但在液谱系统的进样中，要求死体积要小（即乏至柱间的连接管路容积要尽可能短小），以便注入的样品能极快地到达分析柱头，确保样品为点状（塞状）中心进样。阀的材料一般为耐酸碱腐蚀的并具良好惰性的聚四氟乙烯、陶瓷、PEEK（聚醚醚酮）等。好的进样装置在进样时引起的流量波动应该是很小的，在谱图上影现出来的扰动也是很小的。当然最为关键的是要有非常漂亮的重复性（这一点也需要其他组件的配合，如泵、柱、检测器来共同保证）。4.液相色谱柱整个液相分析过程中，液相色谱柱是分析好坏、成败的关键，其作用的重要性犹如人的心脏。除开液相色谱柱外，其它所有的组件都是服务于液相色谱柱的（泵提供恒流溶剂用于淋洗、进样器定量注入样品，检测器响应出被柱分离后的单独组分含量的信号，工作站处理检测器的信号给出样品混合物的定性、定量数据）。由此可见，HPLC系统中液相色谱柱是非常关键的。它的好坏直接影响样品的分析效果。对于这个核心的关键组件，要求它必须分离能力要强（便于将复杂混合物逐个分离清楚）、柱容量要大（便于提高进样量以利于痕量分析，使之能检测出更小的浓度含量的样品）、分析速度要快（能做到0.5Hr内完成分析全过程，提高分析效率）。液相柱的尺寸规格主要有两种，一种内径为4.6mm、另一种常见内径为2.0mm。柱子的长度由分析情况决定，但由于受柱前压（泵压≤40MPa）的限制，一般为10-25cm。由于液相柱需要有非常高的柱效（N≥40000），因此对于柱内表面光洁度、柱内死体积都要求很高。柱内表面一般需要抛光，其光洁度应在8级以上，并且要绝对避免轴向沟槽出现，以免样品产生轴流扩散（即部分样品从柱头顺着轴向沟槽不经柱内的二相交互区的相互作用就直接流出了液相柱子，没有完成分离过程），严重降低柱分离效能。径向沟槽对分离影响不明显，但也应尽可能避免，保持光洁。从液相色谱柱的结构图中可以看出，除了要求柱内表面光洁无沟槽外，它的柱头结构也是非常科学的。此结构设计最大程度地缩小了死体积，并使溶剂流组分径向分布均匀，并且保持层流。减小了样品组分的横向扩散以及涡流、湍流形成的流型紊乱造成样品组分扩散，从而很好地保证柱的优秀的分析效能。在柱头的放大结构示意图上，不锈钢烧结的筛板（板上的贯通微孔直径＜5um=0.005mm，就是保证实现溶剂流在柱内轴向层流（平流）流动的关键组件，另外它也能保护柱内的填充料（固定相），将大的颗粒物柱填充料外侧，保护柱不被堵塞，能正常分析。应该来讲，柱子的本身的结构很好地将柱头效应（因其结构所引起的分离效能的下降）的影响控制在最小程度，应拥有突出的柱效。但实际并不如此，柱效往往还受到柱外效应与柱内效应的严重影响，尤其是柱外效应尤为突出。柱外效应由柱前与柱后两部分死体积所引起：柱前部分是进样阀与柱头间的连接管路容积（死体积）内的溶剂造成样品组分被稀释扩散（进样时是点状或塞状中心进样）及其流型（因管路结构引起）偏离层流所带来的影响；柱后部分是柱出口与流过池间的连接管路容积以及流过池本身容积造成样品分离后单组分被稀释扩散（表征在半峰宽变宽）及其流型（因管路与流过池结构引起）偏离层流所带来的影响。因此要保持柱的高效性，除了柱本的身合理设计外，还应充分考虑柱外效应等其它因素所带来的影响。液相色谱分析柱优越的分离能力，上述的柱设计以及柱外效应对它是非常重要的，但并非是最为关键的因素。高的液相柱柱效关键在于柱内填充物（固定相）所起的分离作用。关于液相柱的分类因所填充物的不同分为几类（主要有液固吸附、液液分配、离子交换、体积排阻等），对各类柱的分离机理现简介如下：a）液固吸附色谱柱：利用柱内所填的吸附颗粒对样品组分的吸附（主要是样品组分分子与吸附物分子间的静电力、氢键力、诱导力），在流动相的冲洗作用下又被脱附下来（主要是样品组分分子与流动相分子间的静电力、氢键力、诱导力）。依据各组分的脱附、吸附能力的差异得到分离。b）液液分配色谱柱：利用样品组分在两种液体间（流动相溶剂与涂在颗粒物表面的固定液---一般为高分子化合物）的溶解度（溶解能力大小的表征）的差异得到分离。c）离子交换色谱柱：利用样品组分中的离子（样品溶在流动相溶剂中必须能解离成离子的）与柱内的离子交换树脂（分阴、阳交换树脂）上可解离的离子间的结合能力的差异完成分离过程，结合能力强的后被冲洗出柱，结合能力弱的将被首先冲洗出柱。离子交换树脂有寿命限制、需要再生处理。d）体积排阻色谱柱：很明显就是利用样品组分分子的体积大小的差异，使之分离。在这里，分子大的将被首先被冲洗出柱。因为柱内的多孔（有贯通的（有利）和半封闭的（有弊））颗粒物的孔径太小（小于分子个体），对大分子没有任何阻挡就从颗粒间隙中流过了。但分子体积小一些的因为可能被冲洗进多孔颗粒物内部的孔道，然后再又被重新冲洗出来，因此在柱内的停留时间要更长些，比分子体积大的要晚出柱。**当然，涉及完全的吸附分离或体积排阻都会多少发生一些不可逆吸附（结合得很牢固，脱附相当困难）、化学吸附（这类吸附完全脱离了物理吸附所依靠的物理作用力，而是由分子外层电子间形成新的键合作用力，从某种意义上讲是形成了新的化学物质）。它的发生降低了柱效，是我们所不希望的。在液相色谱柱的繁杂的分离机理前,我们不作过多介绍,详细论述请参见相关的书籍。这里主要就HPLC系统中最为广泛使用的C18反相液-液分配色谱柱作一简单描述。反相色谱：是指流动相溶剂的极性大于其固定相极性的一类分离模式。它应用广泛，主要因为自然界中大部分有机化合物都存在着非极性基团，这些基团可与固定相的非极性基团相作用，进行分离。如C18反相柱，固定相因球状硅胶颗粒表面所涂的十八烷而非极性；其常用流动相为水、甲醇、乙晴等强极性溶剂。使用这类柱的谓之反相色谱。C18反相液-液分配色谱柱的固定相颗粒的示意图如下：举报删除此信息风车田(站内联系TA)由上图，固定液（十八烷）均匀涂布在担体（球状硅胶颗粒）上，硅胶颗粒很细，其直径一般为5um，是液谱柱固定相常用的固定液承载体（即担体），这种均匀的涂覆并不是一般物理性覆盖在球体表面上。从它的化学结构可见，C18烷基基团与球体硅胶表面的化学基团（硅醇基团Si-OH）发生化学作用，形成非常稳定化学键合结构。这样结构称为化学键合结构，固定相称为化学键合固定相。键合固定相能很好地耐酸、耐碱、耐有机溶剂的冲洗，是液谱柱固定相中最为理想、也应用最为广泛的固定相。此种结构有如下优点：1、硅胶球体颗粒小而匀称，其表面没有坑点形成液坑，因此传质快（阻力小了），柱效能高。2、固定液是化学键合在表面的，非常稳定，不易流失，增加了柱的稳定性与寿命。其表面处理上固定液后，消除了活性中心，提高了柱效。3、由于可以在硅醇基团Si-OH上键合上其它不同极性的官能基团（C18中的十八烷基团属于非极性基团），能灵活地改变分离的选择性（键合上极性基团，适宜分离极性混合物；反之，键合上非极性基团，适宜分离非极性混合物）4、由于键合柱稳定性优秀，它有利于梯度洗脱。***极性越弱，；极性最强，越易溶于水，难溶于油。在液相色谱柱上常用的固定液有：正十八烷（极性最弱）、聚酰胺、PEG-20M、β-β；---氧二丙晴（极性最强），不同的分析要求，可依据极性大小来选用所需的合适极性的固定液。在HPLC的分析中，液相色谱柱的选择可以参考以下几点：1、柱长度：以满足样品的分离为依据，通常是10-25cm，特殊情况下，为满足组分分离，在压力（泵出压力、材料耐压）允许的前提下，可以将几根柱串联使用，以增加柱效，完成分离。2、柱内径：通常为2.0或4.6mm，它依据