关于TOPO和GATEWAY

关于TOPO和GATEWAY一、TOPO平端克隆拓扑异构酶简介–TOPO®克隆载体利用了DNA拓扑异构酶I，加快了PCR克隆–拓扑异构酶I在位点CCCTT切断并松弛超螺旋DNA，然后重新连接末端。这样，其同时作为限制酶和连接酶。TOPO克隆原理TOPO克隆是一种将拓扑异构酶与T-载体相结合的PCR产物快速克隆系统pCR-TOPO，无需DNA连接酶做连接。牛痘（Vaccinia）病毒拓扑异构酶Ⅰ可以结合在双链DNA的特异位点上，并可在一条链上于5’-CCCTT序列之后打开磷酸二酯键（cleavethephosphodiesterbackbone），释放出的能量可催化DNA切口处的3'磷酸基团与拓扑异构酶的第274位的酪氨酸（Tyr）残基共价结合，同样这个共价键又会受到切口处5'羟基的攻击，进行可逆反应，恢复切口处磷酸二酯键，重新将DNA连接起来。pCR-TOPO载体就是根据拓扑异构酶Ⅰ的这一性质来开发的，pCR-TOPO载体也是一种T载体，只是在其3'末端的突出T上共价结合了一个拓扑异构酶Ⅰ，当带3'末端的突出A的PCR产物与该T载体互补配对时，拓扑异构酶Ⅰ就将该缺口连接起来。pCR-TOPO载体的工作模式图（图1）pCR-Blunt克隆载体pCR-Blunt是一种用于提高克隆平末端片段效率的载体，该载体最大特点是在lacZ‘基因的下游融合了一个ccdB（Controlofcelldeath）基因，该基因对大肠杆菌是致死的。该载体大小为3.5kb，含卡那霉素抗性基因和Zerocin抗性基因。在克隆外源平末端DNA片段时，先将改载体切成线状，再与目标DNA连接，转化大肠杆菌。如果载体发生自连，获得这些载体的大肠杆菌宿主细胞就会死亡，只有当外源DNA片段与载体连接后，ccdB基因的表达受到阻断，重组质粒才能在大肠杆菌中存在下来。如果没有DNA片断插入，ccdB基因则会表达，ccdB基因的表达蛋白，会破坏细菌的DNAgyrase（促旋酶），造成细菌染色体的降解导致细菌死亡。如果有插入片断，则ccdB基因表达受到阻碍，所以细胞可生长。这样可以把高背景的缺点改善，节省筛选的时间。Topo平端克隆与TopoTA方法一样，操作简单快速（图2）TOPO克隆高效性原理Topo连接反应有两个分子参与，而传统的连接反应有三个分子参与，其热力学上的优势导致5分钟的快速连接。（图3）实验步骤及方法1、进行扩增，得到目的产物，检测，无需纯化2、进行TOPO克隆试剂化学感受态细胞电子感受态细胞新鲜PCR产物盐溶液稀释盐溶液1：4水pCR-BluntII-TOPO0.5-4μl1μl——加至5μl1μl0.5-4μl——1μl加至5μl1μl总体积6μl6μl（表1）1)连接：按上表进行配制溶液后，轻轻混匀，室温静置5min2）转化：将试管置于冰盒中进行冰浴5-30min3）然后在42℃热击30S’后立即冰浴4）在室温下添加250μlS.O.C.培养基5）37℃，200rpm，摇床孵化1h6）用10-50μl，涂于平板上，正放5min后，37摄氏度倒置培养过夜7）直接进行PCR检测，或挑取菌落在50μl含有50μg/ml氨苄或25μg/mlZeocin™的LB培养基（置于200μl微量离心管中）培养4h或者：FreshPCRproduct1.33µl(fromStep1)SaltSolution0.33µl(inkit（试剂盒）in-20°Cfreezer)TOPOVector（载体）0.33µl(inkit（试剂盒）in-20°Cfreezer)FINALVOLUME2.00µl1)连接：按上表进行配制溶液后，轻轻混匀，室温静置5min2）转化：将试管置于冰盒中进行冰浴5-30min3）然后在42℃热击30S’后立即冰浴4）在室温下添加83μlS.O.C.培养基5）37℃，200rpm，摇床孵化1h6）用10-50μl，涂于平板上，正放5min后，37摄氏度倒置培养过夜7）直接进行PCR检测，或挑取菌落在50μl含有50μg/ml氨苄或25μg/mlZeocin™的LB培养基（置于200μl微量离心管中）培养4h二、Gateway技术Gateway®克隆的强大性和灵活性在目的基因（go或者开放阅读框(ORF)克隆进Gateway®入门载体后，可以很容易将它转移到任何目的载体，创建各种各种各样的表达克隆。当每一个基因具有进行Gateway®重组的att序列时它们就可能在载体间穿梭。Gateway技术原理Gateway克隆技术是利用λ噬菌体与大肠杆菌的染色体之间发生的λ嗜菌体位点特异重组系统的重组整合与切出反应（attBxattP→attLxattR）BP和LR两个反应构成的（表2和图4）。BP反应利用一个attBDNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。反应反应位点产物产物结构BP反应attB×attP入门克隆attL1-基因-attL2LR反应attL×attR表达克隆attB1-基因-attB2表2图4即，完成构建Gateway™表达克隆仅需两步（图4）：1、创建Gateway克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。2、混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及Gateway™LRClonase™酶，产生表达克隆。（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。）Gateway™技术也利用了ccdB选择方法，以确保高效率的分离重组克隆。典型的效率是＞95％。Gateway的适用：目前，可以通过以下几种方法构建Gateway™入门载体。无论选择何种方法，创建的入门载体都是用来与各种目的载体进行重组。1、定向TOPO®克隆至gateway载体与供载体BxP重组2、限制性内切酶消化和连接进入入门载体3、使用pCMV·SPORT6或pEXP-AD502*构建Gateway™兼容cDNA文库4、Gateway™改造过的克隆载体关于PCR-定向(PCR-Directional)TOPO®克隆目前有两种定向TOPO®克隆载体:pENTR/D-TOPO®和pENTR/SD/D-TOPO®（表3和图5），它们具有有以下特点：1、位于PCR产物插入位点两侧的attL重组位点可以与Gateway™目的载体进行有效重组2、通用M13位点便于测序3、基于pUC的ori位点提供高产量质粒4、大肠杆菌中卡那霉素（kanamycin）抗性基因筛选载体特点优点pENTR/D-TOPO®无SD(Shine-Dalgarno)位点真核细胞中天然、N-或C-端融合；大肠杆菌中N-端融合；如果基因包含有SD序列，可在大肠杆菌中进行C-端或天然蛋白表达pENTR/SD/D-TOPO®含SD(Shine-Dalgarno)位点包含基因10和一个SD序列，可以有效的启动天然蛋白和融合蛋白在大肠杆菌中的表达（表3-两种pENTR/D-TOPO®载体的简单比较）定向TOPO的使用方法：1、在5’PCR引物的5’末端设计一个CACC(在3’引物上不需要任何修饰)2、正常方法扩增3、将PCR扩增产物和DirectionalTOPO®载体，孵育5分钟，然后转化E.coli。注意：•3´引物不能包含和5’引物末端GTGG的同源序列•定向TOPO®克隆载体只接受平末端PCR产物•引物不能含有5’磷酸•设计引物时要考虑阅读框是否可以得到有功能的N端或C端融合蛋白附：M13引物引物序列M13-S5´-GTAAAACGACGGCCAG-3´M13-R5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´