关于YMDD变异型乙型肝炎病毒治疗对策

综述关于YMDD变异型乙型肝炎病毒治疗对策序论拉米呋啶（Lamivudine；2、3-dideoxy3-thiacytidine;3TC）是一种核酸诱导体，在细胞内转换为拉米呋啶三磷酸盐后插入由乙型肝炎病毒（HBV）的前基因组RNA逆转录形成的DNA的盐基内，从而抑制病毒复制。拉米呋啶原用于HIV感染的患者即AIDS患者的治疗，但是1991年在培养细胞内发现能抑制HBV，从而进行以抑制HBV为目的的研究。1993年在报道拉米呋啶可抑制感染猩猩和鸭子的HBV类似的病毒，同年亦报道其对于乙型肝炎患者2期临床试验的肯定效果。随后从1994年开始美国及欧洲各国都报道拉米呋啶对多种类型慢性乙型肝炎患者具有良好的抗病毒疗效及改善肝功能，从而得到世界各国专家的关心。还有拉米呋啶可口服较方便，较之前类似的药物不同的是每天口服至300mg几乎无副作用，并且对于肝功能差的肝硬化患者多数是安全的，认为是其最大的优点。1－6与之前用于治疗乙型肝炎具有抗病毒疗效的干扰素为注射剂副作用大价格高的缺点相比较，拉米呋啶具有为口服药物几乎物副作用价格较低的优点，故许多临床医生逐渐把拉米呋啶认为是治疗乙型肝炎抗病毒疗法的首选。另外，拉米呋啶无法对细胞内cccDNA（共价闭合环状DNA）产生影响，故为得到充分的抗病毒疗效长期维持疗法是必需的。但是长期应用拉米呋啶可出现变异种，是限制拉米呋啶广泛应用的主要原因。从而本论文分析作为慢性乙型肝炎抗病毒疗法的拉米呋啶在长期应用时变异种发生的频率、发生机理及临床表现，探讨发生变异种时其治疗方法。拉米呋啶变异种发生频率HBeAg阳性的慢性肝炎患者应用拉米呋啶1年时，17－33％患者血清中HBeAg消失，同时16－18％的患者转换为HBeAb，与对照组的11％和5％相比较是有意义的。5－13而且，应用拉米呋啶1年以上时HBeAg血清转换率也逐渐增加。Liaw等报道应用拉米呋啶1年后17％的HBeAg血清转换率在2年后升至27％，14Chang等亦报道应用拉米呋啶1年、2年、3年及4年后HBeAg血清转换率为22％、29％、40％及47％逐年升高。15然而，应用拉米呋啶的时间越长，其出现病毒变异种的频率越高。据报道西方人应用拉米呋啶1年、2年及3年后患者出现YMDD（酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸）变异的比例为16－32％、47－56％及69－75％，16亚洲人为14％、38％及57％。14，17同时，应用拉米呋啶后一旦HBeAg消失，其发生YMDD变异的可能性较低。18－20据报道HBeAg阴性的慢性肝炎患者出现抵抗拉米呋啶变异种的变异率为多种多样的（1年后0－27％，2年后10－56％）21－24据报道一般HBeAg阴性的慢性肝炎患者和HBeAg阳性的慢性肝炎患者的YMDD变异种出现的比例是相似的，但是亦有报道HBeAg阴性的慢性肝炎患者的YMDD变异种出现的比例明显低于HBeAg阳性的患者值得去注意。24，25这是有无precore变异种对长期应用拉米呋啶时变异种的发生产生影响的一种意见，以后需要得到证实。目前为止，为了减少拉米呋啶变异种的发生联合应用作用机制不同的干扰素得到部分肯定的结果。7，26－28张等把83个慢性乙型肝炎患者随机分为拉米呋啶联合应用干扰素组（41个）和只应用拉米呋啶组（42个）并且观察1年以上。结果，联合应用组1年、2年及3年后病毒变异种发生率为6％、22％及32％，明显低于只应用拉米呋啶组的10％、57％及59％（见图1）。29而且病毒反弹（breakthrough）时确定HBV类型的结果，联合应用组患者中5/9（56％）检测出YMDD变异种，而拉米呋啶组为18/22（82％）（见图2）。故认为联合应用拉米呋啶和干扰素疗法可抑制YMDD变异种的出现，从而减少病毒反弹。拉米呋啶变异种病毒的发生机理拉米呋啶变异种时大部分HBV-DNA多聚酶基因C区的YMDD位点（酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸）出现变异，第552密码子的蛋氨酸变异为缬氨酸（M552M,YVDD）或异亮氨酸（M552I,YIDD）。这两种YMDD变异可伴有528密码子亮氨酸变异为蛋氨酸（L528M），在YVDD突变体更为常见。30－32此变异病毒与野生株相比较其复制能力明显降低，33但是亦减少拉米呋啶和其他核苷酸类似物对病毒复制的抑制效果从而具有耐药性。34据报道在体外研究中，只具有L528M变异的HBV变异种与野生株相比较对拉米呋啶疗效减少约6－18倍，而只具有M552V的HBV变异种与野生株相比较对其对拉米呋啶的抵抗能力约150倍。同时具有上述两种变异种时与野生株相比较对其对拉米呋啶的抵抗能力约80000倍。32，34，35同时，除YVDD和YIDD变异种外可观察到L428/I,T532S,T476N,V521/L,S561T,A548V的HBVDNA多聚酶的其他位置氨基酸的变异，这些少数变异种对拉米呋啶的耐药性如何与野生株相比较病毒复制能力是怎么样尚未明确。32，36－40但是综合目前的研究结果，YMDD序列之外的多聚酶变异种单独存在时其拉米呋啶耐药性不明显，而同时伴有YMDD变异时增加拉米呋啶的耐药性可引起其他核苷酸类似物的交叉耐药性。35，41，42尚不清楚YMDD变异种对拉米呋啶耐药性的机制。但是在YMDD变异种认为是拉米呋啶结合部位的多聚酶基因C区发生突变导致多聚酶蛋白发生立体构造的变化从而发生与拉米呋啶结合能力的降低发生耐药性。32，43－45拉米呋啶变异种出现时期、临床表现及经过临床上应用拉米呋啶治疗后，未检测到的血清HBV-DNA在持续的拉米呋啶治疗的情况下有2次以上升高的情况定义为病毒反弹（viralbreakthrough）。一般约90％的患者是由于YMDD变异导致的。32然而服用药物不规则或自行停药时没有出现变异种而是病毒再次复制出现此现象，故长期应用拉米呋啶时观察到病毒反弹现象应仔细询问患者服用拉米呋啶情况。YMDD变异出现在病毒反弹1－4个月之前。46一般来说YMDD变异发生在应用拉米呋啶6个月后出现，然而亦有报道应用拉米呋啶数周后甚至应用拉米呋啶之前血清中测出YMDD变异种。47－49出现反弹现象时血清HBV-DNA转阳、ALT再次升高，与应用拉米呋啶之前相比较血清HBV-DNA及ALT维持较低水平。16，17这表示变异型病毒与野生型病毒相比较复制能力及致病性低。但是当患者出现YMDD变异种时血清ALT升高至正常值5倍以上的急性加重过程。Liaw等50报道，发生YMDD变异的32个患者中13个患者（40.6%）出现YMDD变异种4－94周（平均24周）后出现急性加重现象，3个患者患者出现肝硬化。同时出现急性加重过程的患者中75％出现HBeAg的血清转换，而不出现急性加重过程的患者中无一人出现血清转换。据报道出现急性加重过程时，血清HBV-DNA值达到最高值1－4周后ALT升至最高值的现象，故发现YMDD变异后血清HBV-DNA值持续上升时注意观察患者有无急性加重现象。据报道特别是非代偿性肝硬化患者出现YMDD变异时出现急性加重现象亦有死亡病例，51－55故肝硬化患者出现拉米呋啶变异时需要及时和积极的对策。出现拉米呋啶变异种预测因素综合目前为止的研究，应用拉米呋啶前血清HBV-DNA值高、男性、体重指数高、接受脏器移植及HIV感染导致免疫力低下的患者受YMDD变异种的影响出现病毒反弹现象。16，55据报道除了上述因素，年龄、HBeAg及有无precore变异种亦为出现YMDD变异种的预测因素（图3）。Yuen等18报道治疗前HBV-DNA或ALT越高发生病毒反弹现象越容易出现。以应用拉米呋啶6个月为起点，若HBV-DNA值大于103拷贝/毫升，其后29个月观察期间63.2％患者发生YMDD变异。此结果表明，血清HBV-DNA或ALT值高的患者病毒复制速度快，故病毒DNA出现变异的机会多并且通过坏死后新再生的肝细胞扩散导致容易发生病毒反弹。除了血清HBV-DNA和ALT值外，应用拉米呋啶之前用泛昔洛韦时容易发生YMDD变异。25，56－58这是可能是因为之前应用泛昔洛韦导致多聚酶B区发生突变的患者应用拉米呋啶后发生C区突变引起双重突变，最终对拉米呋啶的抵抗性明显升高。YMDD变异株的治疗对策1、出现YMDD变异株时停止应用拉米呋啶？还是继续应用？出现YMDD变异株引起病毒反弹时停止应用拉米呋啶或者还是继续应用仍有争议。出现拉米呋啶抵抗性的YMDD变异型病毒仍应该应用拉米呋啶的观点有如下依据。第一，变异型病毒较野生株比复制能力低33，故较应用拉米呋啶之前血清HBV-DNA和ALT维持低水平。第二，出现变异种后继续应用拉米呋啶时约有25％的患者HBeAg有望出现血清转换4，14，17，46，并且改善组织学分级。5，6，14，17，59第三，持续应用拉米呋啶仍可抑制复制能力强的野生株。最后，长期应用拉米呋啶几乎无副作用。据报道，发生YMDD变异后停用药物3－4个月后被复制能力强的野生株替换，此时重新应用拉米呋啶早期无反应而变异型病毒再次出现的速度快。45，60不管是否出现变异株，长期规则地应用拉米呋啶的患者突然停用药物时约16％的患者有血清ALT急剧上升的急性加重现象。61故认为出现YMDD变异后仍持续应用拉米呋啶对患者有利。但是最近陆续报道出现YMDD变异型时持续应用拉米呋啶是否有效的临床对照试验，对此的否定意见逐渐增多。2002年在美国消化学会（DDW）Liaw等62报道，出现YMDD变异种后急性应用拉米呋啶的66个患者和停止应用的62个患者的追踪观察结果，停止应用拉米呋啶的患者出现HBeAg血清转换更为常见。朴等的研究中，HBeAg阳性的慢性肝炎患者长期应用拉米呋啶中发生病毒反弹的55个患者在随后28个月期间持续应用拉米呋啶观察结果，1年后约5.4％的患者出现HBeAg血清转换。特别是大多数出现HBeAg血清转换的患者持续应用拉米呋啶时3年内可再次出现病毒反弹。63另外，朴等的研究中，发生病毒反弹的患者持续应用拉米呋啶1年后只有4％的患者出现HBeAg血清转换，发生病毒反弹时血清ALT值较应用拉米呋啶之前升高的72例中持续应用拉米呋啶的46例和停用药物的26例临床经过的比较，两组患者HBeAg血清转换率和血清ALT值正常化率是类似的。64以这些结果为背景，最近出现YMDD变异种时停用拉米呋啶更为有利的主张亦有说服力。2、新抗病毒剂的应用为寻找长期应用拉米呋啶导致的YMDD变异种的有效治疗方法，研究对YMDD变异种具有新作用机制的新药。结果，低剂量的阿德福韦认为对YMDD变异种具有很好的抑制病毒复制和安全性，故作为慢性乙型肝炎的抗病毒药物在食品与药物管理局（FDA）得到公认。阿德福韦酯是非环状脱氧腺苷酸类似物，最初为抑制HIV复制目的所开发的。然而，抑制HIV复制所需要的阿德福韦的剂量是抑制HBV复制的10倍左右的高剂量（100－120mg/day），应用此剂量时诱发肾毒性的可能性非常大，故现在未用于HIV的治疗。65同时，阿德福韦的细胞内活性代谢物质的阿德福韦二磷酸可抑制HBV-DNA多聚酶，低剂量也可有效抑制HBV的复制。大规模多中心临床研究中，应用48周阿德福韦具有与拉米呋啶相似的抗病毒效果65－67，长期应用60周时未发生病毒抵抗性。68，69然而，最近应用96周阿德福韦的HBeAg阴性124个慢性肝炎患者中有2个人出现具有病毒抵抗性的变异种。70对阿德福韦耐药的HBV在逆转录酶的236密码子的天冬酰胺转变为苏氨酸（rtN236T）。70，71在体外对阿德福韦具有约6－15倍抵抗性的变异种对于拉米呋啶的药物敏感性不产生影响。70据报道对拉米呋啶耐药的L528M＋M552V的变异种在体外对阿德福韦具有5倍的敏感性后72，在体内单独应用阿德福韦或与拉米呋啶联合应用疗法可有效抑制拉米呋啶变异种的复制。73－76Perrillo等77观察1年对拉米呋啶耐药的135个患者，86个患者同时应用拉米呋啶和阿德福韦而49个患者同时应用拉米呋啶和胃药。结果，大部分同时应用阿德福韦的患者（85％以上